灑精對大鼠腦內血管超微結構及CD146蛋白表達變化的影響.pdf

1、過量飲酒對健康造成極大損害，并引發(fā)眾多不良社會后果，每年造成約250萬人死亡，更為可怕的是越來越多的年輕人受到影響。世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《酒精與健康全球狀況報告》中指出，酒精是世界上第三大導致疾病的危險因素。國內外研究表明大量飲酒可通過多種途徑促進腦血管意外的發(fā)生，但其具體機制尚未明了。在法醫(yī)學實踐中，大量飲酒后輕度外力作用導致蛛網膜下腔出血(SAH)的案件較為常見，大量飲酒對腦血管的損傷以及飲酒在此類案件中的參與度問題成為法醫(yī)學、臨床醫(yī)

2、學及基礎醫(yī)學的研究焦點。CD146為黑色素瘤粘附分子，在所有人血管內皮細胞上成陽性表達，為血管內皮粘附分子。
　　 目的：本實驗目的是在建立大鼠飲酒模型的基礎上，采用頂空氣相色譜儀檢測大劑量飲酒后血乙醇濃度(BAC)的變化情況；應用自動凝血分析檢測儀測定飲酒不同時間大鼠凝血功能系列指標，觀察分析各指標變化的內在聯系；通過HE染色、免疫組織化學染色以及透射電子顯微鏡(TEM)技術與方法，深入觀察飲酒大鼠腦血管內皮細胞及其細胞間連接

3、的改變，觀察CD146在腦血管內皮細胞的表達情況，探討其在大量飲酒后內皮細胞連接改變中的作用，進一步闡明大量飲酒對腦血管的影響及作用機制，為飲酒后輕度外力作用導致SAH案件的飲酒參與度鑒定提供理論基礎。
　　 方法：健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重220g±10g，用市售白酒北京紅星二鍋頭(56％v/v)制備模型，采用大鼠灌胃器進行灌胃，實驗前均給予適應性蒸餾水灌胃1周。
　　 1、不同時間BAC測

4、定：取6只220g±10g雄性SD大鼠，以56％v/v1.2mL/100g給予白酒灌胃一次，分別于灌胃后0.5h、1h、2h、3h、6h、12h共6個時間點，由內眥眶內靜脈叢取血，左右眼輪換，每次每只取血約200-300μl，密封。應用頂空氣相色譜儀檢測各時間點BAC，確定該劑量白酒灌胃后BAC峰值的出現時間。
　　 2、將60只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組、飲酒1次組、飲酒7天組、飲酒14天組、飲酒21天組、飲酒28天組。飲

5、酒各組以56％v/v1.2mL/100g/次的灌酒量進行灌胃。除飲酒1次組，其他各飲酒組每天白酒灌胃2次，間隔10小時。正常對照組用等體積蒸餾水代替白酒進行灌胃。在此期間觀察大鼠的行為學改變，測量并記錄大鼠體重變化情況，記錄存活情況。各組末次灌胃后抽取心血，斷頭取腦組織、肝臟組織。取血后全自動凝血分析儀檢測凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間（APTT）及纖維蛋白原（FBG）。肝組織制備石蠟切片，進行HE染色觀

6、察；全腦固定制作石蠟切片，應用免疫組織化學方法觀察大鼠腦血管CD146蛋白的表達變化；應用TEM觀察大鼠基底動脈及大腦中動脈的病理損傷情況。
　　 數據采用均數士標準差(Mean±SD)表示，用SPSS16.0統計分析軟件進行統計學分析，各組均數的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，以P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結果：
　　 1、大鼠行為學改變，體重變化：大鼠白酒灌胃操

7、作較蒸餾水灌胃困難。大鼠飲酒后短時間內出現不同程度的興奮性增加的表現，20min后逐漸出現昏睡，翻正反射消失等急性酒精中毒臨床表現。隨著后期實驗時間延長，飲酒組進食量減少，灌胃時抵抗反應減輕，飲酒后未見明顯興奮性增強表現，活動性減弱，反應遲鈍，給予灌酒14天后個別大鼠出現肢體偏癱。體重增長緩慢，21天組和28天組大鼠體重與對照組相比增長明顯減少。
　　 2、BAC:按照56％v/v1.2mL/100g劑量給予大鼠一次性灌酒，BA

8、C在0.5小時為190.29±29.34mg/dl，至1小時濃度達到峰值，為225.06±43.10mg/dl，2小時BAC為194.08±32.30mg/dl，之后濃度逐漸下降，至12h為25.37±18.21mg/dl。說明大鼠飲酒后約1-2h乙醇吸收達高峰。
　　 3、凝血功能指標檢測：各組末次灌胃后2小時采取血漿。飲酒14天組TT明顯縮短，與其他各組均有顯著差異；飲酒14天組PT延長，與其他各組均有顯著差異；飲酒各組AP

9、TT與正常對照組沒有明顯差異；飲酒7天組FBG延長，與其他各組有顯著差異。
　　 4、組織病理學改變
　　 4.1肝臟病理學改變：對照組可見肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細胞形態(tài)規(guī)整，肝小葉結構清晰；飲酒1次組可見肝細胞水腫伴部分肝細胞輕度脂肪變性，隨著飲酒時間的增加可見肝細胞脂肪變性的加重，炎細胞聚集，進而又出現多發(fā)片狀壞死。
　　 4.2CD146免疫組織化學結果：正常對照組以及飲酒各組腦實質微血管、靜

10、脈、蛛網膜下腔血管和基底動脈血管壁均有CD146陽性表達，其中動脈血管壁主要在平滑肌層表達，靜脈及微血管在內皮細胞表達明顯。其中對照組表達為(+)，1次灌酒組所有類型血管中陽性表達為弱陽性（±），7天組、14天組、21天組各類血管陽性表達逐漸加強（++～++++），28天組陽性表達明顯減弱（±）。在各實驗組中，腦實質毛細血管及微小血管陽性表達的變化較基底動脈、大腦中動脈及其他小動脈明顯。
　　 4.3腦基底動脈、腦中動脈超微結構

11、改變：實驗7天組內皮細胞間連接開始出現小階段融合，實驗14天組至28天組內皮細胞損傷逐漸加重，出現內皮細胞形態(tài)不規(guī)則，內皮細胞細胞間質可見圓形大空泡，新生吞飲小泡增多，粗面內質網脫顆粒現象。表面微絨毛卷曲，微絨毛凸起減少，細胞間緊密連接融合部分逐漸增加，模糊不清。各組基底動脈內皮細胞的改變與大腦中動脈的內皮細胞變化未見明顯不同。
　　 結論：
　　 1、飲酒不同時期處死大鼠（處死時間均在飲酒后2小時)，檢測結果表明大鼠凝