基于誘導表位印跡策略的腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)研究.pdf

1、近年來，選擇合適的配體如多肽、抗體、核酸適配體等修飾于遞藥系統(tǒng)，用于特異性的識別腫瘤細胞膜表面特定的受體并與之結(jié)合，是實現(xiàn)腫瘤靶向的重要策略之一。分子印跡技術(shù)是以制備分子印跡聚合物為目標，選擇合適的模板分子，人工合成具有特異性分子識別功能物質(zhì)的一種技術(shù)。分子印跡聚合物與其模板重結(jié)合的過程類似于拿“鑰匙”開“鎖”的過程，與天然抗體相比，分子印跡聚合物作為“人工抗體”具有制備可控性強、理化性質(zhì)穩(wěn)定、抗干擾能力強等優(yōu)點，并且具有一定三維空間結(jié)

2、構(gòu)的模板印跡聚合物與模板分子進行特異性結(jié)合的能力遠遠強于一級結(jié)構(gòu)的模板印跡聚合物。本課題組前期將分子印跡技術(shù)與多肽設(shè)計相結(jié)合，提出以具有二級結(jié)構(gòu)的多肽作為模板分子的構(gòu)象表位印跡策略，并將其用于腫瘤靶向藥物遞送。其選取p32蛋白末端關(guān)鍵氨基酸序列嫁接于蜂毒明肽apamin，設(shè)計合成α螺旋構(gòu)型的多肽并將其作為模板分子制備印跡納米粒，用于p32蛋白高表達的腫瘤靶向藥物遞送。然而，p32蛋白末端為特殊的α螺旋結(jié)構(gòu)，生物體內(nèi)大部分膜蛋白的末端沒有

3、特定的二級結(jié)構(gòu)，使得這一策略有了局限性。那么對于大部分末端無固定二級結(jié)構(gòu)的膜蛋白，我們可否將其末端誘導為一定的二級結(jié)構(gòu)，以期其與印跡納米粒發(fā)生較強的特異性結(jié)合呢？基于此，本論文特提出誘導表位印跡策略，即選擇合適的誘導劑將線性肽誘導為α螺旋結(jié)構(gòu)，并以“α螺旋化”的多肽作為模板合成分子印跡納米粒，該納米?？蓪⑵湎鄳?yīng)的膜蛋白末端誘導趨向于α螺旋，并發(fā)生較強的特異性結(jié)合作用。以葉酸受體（Folate receptor, FR）為模型，多種腫瘤細

4、胞表面高表達葉酸受體，常將其作為靶點用于腫瘤靶向藥物遞送，而葉酸受體蛋白N端多肽鏈（FN）為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)，選擇合適的誘導劑將FN肽誘導為α螺旋，以“α螺旋化”的FN肽為模板分子，合成分子印跡納米粒（MIPNP-F），特異性的識別并誘導細胞膜表面FR末端多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)趨向于α螺旋，并進行特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)腫瘤靶向。更值得關(guān)注的是，葉酸（Folic acid, FA）與FR的結(jié)合口袋遠離FR末端，可有效避免游離葉酸對MIPNP-F的靶

5、向效果產(chǎn)生競爭性抑制。
　　本研究分為兩個部分：第一部分對誘導表位印跡策略進行可行性分析。分別以apamin（α螺旋結(jié)構(gòu)）及其線性衍生物linear apamin（apamin的4個半胱氨酸替換為丙氨酸）為模板分子，采用沉淀聚合法制備具有α螺旋“孔穴”的分子印跡納米粒（MIPNP-A）和具有無規(guī)則線性“孔穴”的分子印跡納米粒（ MIPNP-L），探究MIPNP-A和MIPNP-L與apamin及l(fā)inear apamin間的相互作

6、用發(fā)現(xiàn)， MIPNP-A可將linear apamin誘導為α螺旋，并發(fā)生較強的特異性結(jié)合，而MIPNP-L對apamin的結(jié)合作用則較弱。該結(jié)果提示，具有α螺旋結(jié)構(gòu)“孔穴”的印跡納米?？蓪⑵渚€性模板肽誘導為α螺旋并發(fā)生較強的特異性結(jié)合作用，反之，有線性“孔穴”的印跡納米粒對α螺旋的模板肽作用則較弱，初步表明在構(gòu)象表位印跡基礎(chǔ)上提出的誘導表位印跡策略具備一定可行性。第二部分對MIPNP-F進行體內(nèi)外功能評價和作為遞藥載體的安全性考察。多

7、肽結(jié)構(gòu)誘導和體外結(jié)合實驗顯示，MIPNP-F可將其線性模板肽的α螺旋比例由5％誘導為36%，并發(fā)生特異性結(jié)合。納米粒-細胞相互作用實時分析結(jié)果顯示， MIPMP-F與HeLa細胞作用有更高的信號響應(yīng)值，KD值（2.81E-8±5.81E-10）也顯著低于非印跡納米粒（Non-imprinted polymer nanoparticles, NIPNP）與HeLa細胞作用的KD值（2.15E-5±3.05E-7）。用熒光顯微鏡觀察和流式細

8、胞儀測定MIPNP-F的細胞攝取情況發(fā)現(xiàn)，在FR高表達的HeLa、KB和PANC-1細胞上， MIPNP-F的細胞攝取量分別為NIPNP的3.89倍、4.05倍和3.46倍，而在FR低表達的A549和MCF7細胞上，MIPNP-F和NIPNP的細胞攝取量沒有表現(xiàn)出明顯差別。探索MIPNP-F胞吞機制發(fā)現(xiàn)，其入胞途徑與葉酸修飾的納米粒（FA-NP）基本一致，主要通過穴樣凹陷內(nèi)吞和大胞飲途徑內(nèi)吞，初步表明MIPNP-F可經(jīng)葉酸受體介導入胞。

9、小動物活體成像檢測納米粒的體內(nèi)分布表明，MIPNP-F的腫瘤積累量明顯高于NIPNP。將光敏劑亞甲基藍包載于納米粒中，用光動力療法進行細胞藥效學評價發(fā)現(xiàn)，在觀察期內(nèi)MIPNP-F組的IC50為2.12μg·mL-1，明顯低于NIPNP組IC50值3.96μg·mL-1；進行體內(nèi)藥效學考察發(fā)現(xiàn)，MIPNP-F給藥組裸鼠皮下瘤大小基本維持不變，而NIPNP組腫瘤則呈增長趨勢。更值得關(guān)注的是，在細胞與游離葉酸孵育以及在裸鼠腫瘤附近給予高濃度葉