硫酸軟骨素酶ABC及Nogo-66受體拮抗劑聯(lián)合鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、目的：研究硫酸軟骨素酶ABC（chondroitinase ABC， ChABC）、Nogo-66受體拮抗劑(Nogo-66(1-40) antagonist peptide,NEP1–40)及鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)聯(lián)合移植對移植神經(jīng)元軸突的再生、生長以及大鼠損傷脊髓功能修復(fù)的作用。
　　方法：（1）對前期實驗凍存的鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞進行復(fù)蘇。體外應(yīng)用全反式維甲酸(all-trans-reti

2、noic acid, ATRA)（濃度1.0umol/L）誘導(dǎo)NSCs。（2）隨機將60只Sprague-Dawleg(SD)大鼠分成6組,每組10只，如實驗過程有死亡，及時補充：假手術(shù)對照組(只做椎板切除)(A組)、脊髓橫斷傷對照組(B組)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)治療組(C組)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)結(jié)合硫酸軟骨素酶 ABC(ChABC)治療組(D組)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)結(jié)合Nogo-66受體拮抗劑(NEP1-40)治療組(E組)

3、、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)結(jié)合硫酸軟骨素酶 ABC(ChABC)及 Nogo-66受體拮抗劑(NEP1-40)治療組(F組)，對B、C、D、E及F組構(gòu)建T10水平脊髓完全橫斷損傷模型。通過5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）標(biāo)記前期經(jīng) ATRA誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NSCs，以備移植。術(shù)后第2天，D組經(jīng)留置導(dǎo)管注入 ChABC10uL/d（濃度：5U/ml），連續(xù)14d；E組經(jīng)留置導(dǎo)管注入 NEP1-401

4、0uL/d（濃度：1ug/uL），連續(xù)14天； F組經(jīng)留置導(dǎo)管注入 NEP1-4010uL/d（濃度：1ug/uL）和 ChABC10uL/d（濃度：5U/ml），連續(xù)14天；A、B和C組經(jīng)留置導(dǎo)管注入PBS液20uL/d，連續(xù)14d；（2）術(shù)后第8d，C、D、E及 F組在無菌條件下用微量注射器經(jīng)留置導(dǎo)管向脊髓橫斷處蛛網(wǎng)膜下腔注入經(jīng) ATRA干預(yù)和 BrdU標(biāo)記的 NSCs10uL（細(xì)胞濃度：2×105/uL）；A、B組經(jīng)留置導(dǎo)管向脊髓

5、橫斷處蛛網(wǎng)膜下腔注入 PBS液10uL；各時間點各組通過注入磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline， PBS）使移植量均等，進行對照。（3）術(shù)前及術(shù)后不同時間點，用 Basso， Beattie，Bresnahan（BBB）評分和體感誘發(fā)電位（Somatosensory evoked potentials，SEP）潛伏期對大鼠后肢神經(jīng)功能改變進行評價。移植后8w取實驗大鼠損傷處脊髓組織制作切片，通過 HE和免疫熒

6、光染色觀察損傷處脊髓組織改變、移植 NSCs存活、神經(jīng)元軸突再生及生長情況。應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同干預(yù)處理間交互效應(yīng)用析因設(shè)計方差分析；組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣 t檢驗，統(tǒng)計學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　結(jié)果：（1）移植2w后觀察到大鼠癱瘓的后肢功能開始恢復(fù)，移植后2w、5w、8w各時間點，移植治療各組功能恢復(fù)均優(yōu)于損傷對照組，組間BBB評分和 SEP潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0

7、5)；組間兩兩比較結(jié)果顯示； B組BBB評分和SEP潛伏期改善情況與C、D、E及F組相比較差（P<0.05）；在移植治療各組中，F(xiàn)組神經(jīng)功能的恢復(fù)最明顯，F(xiàn)組與C、D及 E組相比，具有較高的 BBB評分和較短 SEP潛伏期（P<0.05），且ChABC和NEP1–40聯(lián)合NSCs移植的效應(yīng)估計值大于兩者單獨聯(lián)合NSCs移植的效應(yīng)之和。（2）移植后8w，HE染色顯示：假手術(shù)組：組織形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列規(guī)則；損傷對照組：組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重

8、破壞，細(xì)胞排列不規(guī)則，大量細(xì)胞結(jié)構(gòu)溶解、消失，可見較大的囊腔以及較多膠質(zhì)瘢痕；各移植組：毛細(xì)血管及細(xì)胞增生明顯，見較小囊腔，尤其聯(lián)合移植組更明顯。（3）免疫熒光染色顯示：僅C、D、E及F組內(nèi)可見橘紅色Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞，Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較結(jié)果顯示：F組陽性細(xì)胞數(shù)多于 C、D和 E組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MAP-2標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)，損傷對照組和移植治療各組之間相比差

9、別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較結(jié)果顯示：C、D、E、F組多于 B組，F(xiàn)組多于 C、D、E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MAP-2陽性細(xì)胞面積，損傷對照組與移植治療各組組間比較有差別(P<0.05)；組間兩兩比較結(jié)果顯示：C、D、E、F組MAP-2標(biāo)記陽性細(xì)胞面積大于 B組， F組大于 C、D、E組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且ChABC和NEP1–40聯(lián)合NSCs移植的效應(yīng)估計值大于兩者單獨聯(lián)合NSCs移植

10、的效應(yīng)之和。
　　結(jié)論：（1）ATRA誘導(dǎo)培養(yǎng)的 NSCs移植、NSCs聯(lián)合 ChABC移植和NSCs聯(lián)合 NEP1-40移植均能促使大鼠脊髓損傷功能的恢復(fù)。（2） ChABC和 NEP1-40聯(lián)合 NSCs共同移植對損傷脊髓處神經(jīng)元軸突的再生與生長、對 SCI功能恢復(fù)的促進作用優(yōu)于單一的 NSCs移植、NSCs聯(lián)合ChABC和NSCs聯(lián)合NEP1-40移植組。（3）ChABC和NEP1–40在聯(lián)合NSCs治療損傷脊髓中具有協(xié)同促