NogO-B調控上皮間質轉化在急性肺損傷后期肺間質纖維化中的作用.pdf

1、背景:
　　急性肺損傷（Acute lung injury，ALI），即急性呼吸窘迫綜合癥(Acute respiratorydistress syndrome，ARDS)，是一種常見的呼吸系統(tǒng)危重癥。盡管采取了綜合的治療手段，其死亡率仍居高不下。即便是部分安全渡過急性期的病人，在其ARDS后期纖維增生階段，肺部發(fā)生成纖維細胞聚集、膠原沉積等纖維增生反應，如無法有效逆轉，會導致肺間質纖維化，使這些患者出現機械通氣依賴、生活質量下降

2、等問題。而肺的纖維增生主要有三種來源:肺上皮細胞經過上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）形成成纖維細胞，循環(huán)成纖維細胞募集入肺，以及肺固有成纖維細胞活化增殖。網狀蛋白4（Reticulon4B，RTN4B），也稱軸突生長抑制劑-B（inhibitor of neurite outgrowth-B，Nogo-b），是網狀蛋白家族的一員，主要定位在內質網上。新近研究表明，它與炎癥發(fā)生及損

3、傷修復均密切相關，在肝纖維化的發(fā)生、宮頸癌細胞HeLa細胞EMT反應中都起到重要作用。本課題組前期研究證實，Nogo-B在肺泡上皮細胞表達，且在ALI發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。那么，Nogo-B在ALI后期纖維增生階段扮演怎樣的角色呢？本課題旨在明確Nogo-B在LPS誘導的小鼠ALI模型后期肺間質纖維化的作用，以期為明確該疾病的發(fā)生發(fā)展機制乃至為治療策略的制定有所幫助。
　　方法:
　　一、體內實驗
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4、實驗對象:野生型C57BL/6小鼠及Nogo-B敲除小鼠，6-8周，雄性。
　?。ǘ┰炷＜胺纸M:通過脂多糖(lipopolusaccharide，LPS)氣管滴入構建小鼠的ALI模型，以等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）滴入構造正常對照模型。隨機分組，收集正常對照組、造模第一天組、造模第四天組、造模第七天組及造模第十天組小鼠的肺組織標本。
　　（三）檢測方法:通過病理切片、Mass

5、on染色、免疫組化、實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitiative PCR，rt-qPCR)、蛋白印跡試驗(Westem Blot，WB)等檢測Nogo-B在ARDS中的表達變化，明確Nogo-B是否參與ARDS后期的纖維增生的過程。同時，檢測纖維增生主要誘導因子轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)以及標志分子上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、平滑肌肌動蛋白α(

6、α-smoothmuscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)表達變化，明確ALI模型后期是否發(fā)生肺間質纖維化，以及Nogo-B的敲除是否會對纖維增生反應有所影響。
　　二、體外實驗:
　?。ㄒ唬┭芯繉ο?小鼠肺泡上皮細胞株(MLE-12)
　?。ǘ┰炷＜胺纸M:選用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾建立Nogo-B低表達MLE組，設立空白對照組及陰性對照組

7、(Negtive siRNA)，并通過TGFβ1誘導MLE細胞EMT反應，收集細胞蛋白及RNA。
　?。ㄈz測方法:通過rt-qPCR、WB對比Nogo-B低表達MLE組與對照組在TGFβ1誘導下Nogo-B表達變化，及EMT反應中上皮及間質分子標記表達變化，進一步明確Nogo-B在其中的作用。
　　結果:
　　一、小鼠急性肺損傷模型中Nogo-B表達變化及其與后期肺間質纖維化形成的關聯(lián)性研究
　　LPS誘導小

8、鼠ALI模型的病理切片顯示，造模第一天小鼠肺部炎癥較重，第四天炎癥反應逐漸減輕而纖維化加重，至第七天和第十天，炎癥基本消退而肺纖維化明顯。而正常對照組小鼠既有少量Nogo-B表達，造模第一天明顯下降，第四天后逐漸增高，高表達持續(xù)至第七天，與纖維增生反應發(fā)生的時間趨勢一致。同時，在造模第一天，纖維增生反應主要誘導因子TGFβ即釋放增加，上皮表面標記E-cadherin表達明顯下降，而隨著時間推進，上皮細胞位置逐漸出現間質細胞表面分子α-S

9、MA及Vimentin表達。第七及第十天TGFβ持續(xù)表達較高，E-cadherin表達明顯下降而α-SMA及Vimentin表達增高。結果提示Nogo-B與肺間質纖維化的發(fā)生相關。
　　二、調控Nogo-B表達對小鼠急性肺損傷模型炎癥反應及后期肺間質纖維化的影響
　　LPS誘導的Nogo-B敲除小鼠與野生型小鼠相比，正常對照組肺組織切片表現基本一致，而造模第一天敲除鼠炎癥程度明顯較野生型重，至第七天仍有部分炎癥反應而野生型小

10、鼠炎癥基本吸收，而第十天與正常組小鼠相比，纖維化程度較正常小鼠輕。同時，在ALI發(fā)生發(fā)展過程中，敲除鼠與野生型小鼠相比，TGFβ表達變化基本一致，而第七天及第十天α-SMA及Vimentin表達較低，提示Nogo-B敲除小鼠雖然經歷更重的炎癥反應，但是后期纖維化反應減輕。
　　三、調控Nogo-B表達對小鼠急性肺損傷模型后期肺間質纖維化影響的可能的機制探討
　　已有文獻表明，在肺間質纖維化的過程中EMT反應在其中起到了重要作

11、用。通過對MLE-12細胞進行siRNA干擾Nogo-B表達和TGFβ1誘導EMT反應，發(fā)現，TGFβ1誘導下Nogo-B表達明顯升高，而進行Nogo-B干擾發(fā)現，干擾組上皮細胞上皮表面標記E-cadherin表達較未干擾組較高而間質細胞表面標記α-SMA及Vimentin表達較低，提示下調Nogo-B影響了TGFβ對細胞EMT的誘導。通過對主要信號通路分子進行檢測發(fā)現，下調Nogo-B組Smad2磷酸化水平下降，說明Nogo-B能通過

12、干擾TGFβ/Smad2通路影響MLE細胞的EMT反應。
　　結論:
　　一、在LPS誘導的小鼠ALI模型中，后期發(fā)生了肺間質纖維化，并且Nogo-B參與了LPS誘導小鼠ALI過程中的炎癥發(fā)生及纖維增生反應。
　　二、Nogo-B敲除鼠與野生型小鼠相比，前期炎癥反應較重而后期纖維化較輕，進一步證實了Nogo-B的存在對LPS誘導小鼠ALI模型中的炎癥及肺間質纖維化的發(fā)生發(fā)展有保護性作用。
　　三、Nogo-B可以