MiR-135b在骨肉瘤復發(fā)和肺轉(zhuǎn)移中的作用和機制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤是兒童青少年中最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤。其治療常因為腫瘤出現(xiàn)耐藥、轉(zhuǎn)移和復發(fā)而失敗。即使是較為激進的治療方案也無法保證患者的長期生存，目前患者的5年總體生存率停滯在60-80％已有三十余年。越來越多的證據(jù)顯示腫瘤干細胞可能是腫瘤耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一，而Notch和Wnt/β-catenin信號通路對于維持腫瘤干細胞的自我更新、耐藥和再生等干性又至關(guān)重要。最新研究表明，這兩種信號通路在腫瘤干細胞中均處于激活狀態(tài)，其部分

2、原因正是由于某種miRNA的失調(diào)。MiR-135b被發(fā)現(xiàn)在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈異常表達，且某些腎小球腎病研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)MiR-135b可激活Wnt/β-catenin信號通路。還有研究顯示，在成骨細胞中，已激活的Wnt/β-catenin通路可以激活Notch通路。基于以上背景，本研究的目的是，探索miR-135b異常表達對骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)的影響，以及其具體的調(diào)節(jié)機制，為未來可能的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法

3、:第一部分:①分別對骨肉瘤原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶標本，以及高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系（LM-5和M132）和低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系（Saos-2和HuO9）中的miR-135b表達進行了定量檢測對比。觀察不同組織標本及細胞系之間miR-135b表達水平的差異。②通過細胞遷移和侵襲實驗，觀察miR-135b表達對骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力的影響。并利用miR-135b過表達Saos-2細胞和正常Saos-2細胞建立動物模型，觀察miR-135b表達對骨

4、肉瘤肺轉(zhuǎn)移及復發(fā)的影響。第二部分:①對骨肉瘤腫瘤干細胞和普通骨肉瘤細胞中的miR-135b表達進行檢測、對比，觀察兩者之間的差異。同時對普通骨肉瘤細胞進行過表達miR-135b干預(yù)，觀察其對腫瘤干細胞干性的影響。②分別對miR-135b過表達骨肉瘤細胞和移植瘤組織中，Notch信號通路下游蛋白HES1的表達和Wnt/β-catenin通路的活性進行對比觀察。同時觀察miR-135b沉默的骨肉瘤細胞中，HES1和β-catenin表達的變

5、化。③構(gòu)建Notch1和/或β-catenin沉默的Saos-2骨肉瘤細胞系，觀察調(diào)控Notch和Wnt/β-catenin信號通路對骨肉瘤細胞中miR-135b的生物學功能影響。④使用靶向掃描V6.2計算算法(miRanda and miRDB)對miR-135b潛在的靶向基因進行篩查。對TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC等可能的靶基因在miR-135b沉默和過表達的骨肉瘤細胞中的mRNA和蛋白表達水平進行檢測，觀察

6、它們的表達水平與Wnt/β-catenin及Notch信號通路之間的關(guān)系。⑤分別將含野生型3'UTR和突變型3'UTR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到不同miR-135b表達的Saos-2和HuO9細胞中，使用RNA免疫沉淀反應(yīng)(RIP)和熒光素酶報告實驗檢測，探索miR-135b靶基因的結(jié)合與否。⑥將miR-135b的靶基因轉(zhuǎn)染到miR-135b過表達的Saos-2和HuO9細胞中，通過測量Wnt/β-catenin通路活性和Notch信號通路相關(guān)蛋白的

7、表達，觀察TET3等靶基因是否直接與miR-135b誘導的Notch和Wnt/β-catenin信號通路激活相關(guān)。⑦在動物試驗中，觀察不同miR-135b表達對腫瘤干細胞誘導成瘤的影響，并按單獨注射順鉑或聯(lián)合使用順鉑和miR-135b抑制劑，將裸鼠分為對照組和試驗組，觀察兩組之間療效的差異。第三部分:①對112例骨肉瘤患者標本的miR-135b表達水平與生存之間的關(guān)系進行了評估。②對骨肉瘤標本中的miR-135b及其靶向基因之間的表達水

8、平及相互間關(guān)系進行了分析。
　　結(jié)果:第一部分:①MiR-135b在骨肉瘤組織中呈高表達。骨肉瘤腫瘤組織和骨肉瘤細胞系中的miR-135b表達顯著高于正常骨和正常成骨細胞。骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶標本中，miR-135b的表達比原發(fā)灶標本要顯著提升;高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系（LM-5和M132）中，miR-135b的表達比低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細胞系（Saos-2和HuO9）中顯著提高。②MiR-135b過表達可刺激骨肉瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)。過表達miR-13

9、5b可在體外實驗中顯著提升MG63和Saos-2細胞的遷移和侵襲能力。更為重要的是，在裸鼠動物實驗中，過表達miR-135b可以誘導Saos-2細胞轉(zhuǎn)移到肺，而對照組的Saos-2細胞并不誘導肺轉(zhuǎn)移。miR-135b表達更高的腫瘤在順鉑治療后，很快又開始生長，而miR-135b正常表達的腫瘤則在治療后30天內(nèi)未再出現(xiàn)生長。第二部分:①MiR-135b過表達可提高骨肉瘤腫瘤干細胞干性。在CD133和ALDH1陽性的Saos-2細胞和HuO

10、9細胞中，miR-135b的表達要遠高于CD133和ALDH1陰性的細胞。過表達miR-135b與正常miR-135b表達對照組相比，可以顯著地增加CD133和ALDH1陽性的Saos-2細胞和HuO9細胞亞群數(shù)量。②過表達miR135b可通過激活Notch and Wnt/β-catenin通路提高骨肉瘤細胞的腫瘤干細胞特性。在miR-135b過表達的骨肉瘤細胞中，Notch信號通路下游蛋白HES1的表達和Wnt/β-catenin通

11、路的活性均比對照組細胞顯著上升。miR-135b過表達還可增加β-catenin在Saos-2和HuO9細胞核中的積累。在miR-135b過表達的Saos-2細胞形成的移植瘤組織中，HES1和β-catenin的表達同樣高于對照組。在miR-135b沉默的MNHG/HOS細胞中，HES1和β-catenin表達與對照組相比受到抑制。③同時敲除Notch和β-catenin可以更有效地抑制miR-135b過表達誘導的骨肉瘤細胞的干性和轉(zhuǎn)移

12、。MiR-135b過表達組中腫瘤干細胞亞群比例最高，Notch1或β-catenin沉默組的腫瘤干細胞比例有所下降，Notch1和β-catenin同時沉默組的腫瘤干細胞比例最低。④骨肉瘤細胞中miR-135b表達與其靶基因TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的表達呈負相關(guān)。TET3、GSK3β、β-TrCP、CK1α和APC的mRNA和蛋白表達水平在miR-135b沉默的MNNG/HOS細胞中均顯著升高。⑤miR-13

13、5b直接與靶基因的3'非編碼區(qū)相結(jié)合。在miR-135b過表達的骨肉瘤細胞中，包含原型3'UTR的質(zhì)粒的熒光素酶活性顯著減低。但含突變3'UTR的質(zhì)粒的熒光素酶活性并不發(fā)生變化。⑥MiR-135b通過TET3等靶基因激活Notch和Wnt/β-catenin信號通路。單獨轉(zhuǎn)染TET3、CK1α、β-TrCP、APC和GSK3β可以部分抑制miR-135b過表達骨肉瘤細胞中miR-135b誘導的Wnt/β-catenin信號通路激活。⑦抑

14、制miR-135b可以有效抑制裸鼠體內(nèi)骨肉瘤腫瘤干細胞導致的肺轉(zhuǎn)移和復發(fā)。抑制miR-135b可完全抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤干細胞誘導的腫瘤形成，而對照組并沒有影響到腫瘤干細胞誘導的腫瘤形成。單獨使用順鉑治療，可使腫瘤縮小，但在治療結(jié)束12天后出現(xiàn)復發(fā)。而聯(lián)合使用順鉑和miR-135b抑制劑進行治療組未出現(xiàn)復發(fā)。在治療4個周期之后，聯(lián)合治療組與單獨使用順鉑治療組及對照組相比，腫瘤干細胞的數(shù)量顯著下降。第三部分:①MiR-135b高表達是患者預(yù)后

15、不良的危險因素。miR-135b表達水平高的腫瘤患者總體生存率和無病生存率均低于miR-135b低水平組。②MiR-135b與TET3、CK1α和GSK3β之間呈明顯負相關(guān)，而與Notch1和β-catenin的表達呈正相關(guān)。Notch1和/或β-catenin的高表達與骨肉瘤患者預(yù)后較差呈強相關(guān)性。但與體外實驗結(jié)果不同，miR-135b與APC和β-TrCP之間并不存在相關(guān)。
　　結(jié)論:①miR-135b在骨肉瘤組織中呈異常高表