滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)在DNA甲基化檢測(cè)芯片及高通量DNA測(cè)序技術(shù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、DNA芯片是通過將大量不同的DNA靶分子按照已知順序固定在固相基片（多數(shù)采用玻片）上組成密集的微陣列（Microarray）或陣列(Array)，利用核酸雜交原理對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)分析。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling circle amplification，RCA)是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在DNA、RNA、SNP、細(xì)胞原位檢測(cè)、全基因組擴(kuò)增方面有較多的應(yīng)用。異常的DNA甲基化與癌癥及許多其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)，發(fā)展高通量和高特異性的DNA甲基

2、化檢測(cè)芯片具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本論文以滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)為主，發(fā)展了多種基因組DNA甲基化檢測(cè)的新的DNA芯片檢測(cè)方法。本論文還針對(duì)新一代DNA測(cè)序技術(shù)中的高密度DNA文庫(kù)制備問題，采用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和在片原位鏈替代方法獲得了可用于測(cè)序的基因組片段芯片。還進(jìn)一步地把高密度磁珠微陣列技術(shù)和微流體芯片技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種高密度磁珠的微流體DNA測(cè)序芯片。
　　 具體內(nèi)容包括：
　　 1、基于分枝滾環(huán)擴(kuò)增(HRCA)技術(shù)的特定C

3、pG位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)芯片。
　　 針對(duì)包含酶切位點(diǎn)的特定CpG位點(diǎn)，提出并實(shí)現(xiàn)了一套新的基于分枝滾環(huán)擴(kuò)增原理的樣本處理方案。設(shè)計(jì)一個(gè)鎖式探針與目標(biāo)DNA序列在CpG位點(diǎn)雜交，并通過甲基化敏感性內(nèi)切酶和連結(jié)酶對(duì)鎖式探針與目標(biāo)DNA同時(shí)進(jìn)行酶切和連結(jié)。當(dāng)CpG位點(diǎn)處于甲基化狀態(tài)，鎖式探針能成功地被連接酶環(huán)化，成為HRCA反應(yīng)的環(huán)狀模板。連結(jié)形成的環(huán)狀模板與HRCA反應(yīng)所需的兩個(gè)引物雜交后啟動(dòng)HRCA擴(kuò)增。將一個(gè)引物末端進(jìn)行丙烯酰胺修

4、飾，可以使HRCA產(chǎn)物固定在丙烯酰胺基片上形成3-維膠基DNA微陣列。通過與CY3標(biāo)記的探針雜交，即可檢測(cè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。利用這個(gè)方法，我們成功地對(duì)位于P15，E-cadherin，hMLHl和MGMT基因上的四個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到甲基化特異性PCR驗(yàn)證。研究表明，該方法快速便捷，可用于高通量定性分析基因組DNA中特定CpG位點(diǎn)的甲基化。
　　 2、基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)的CpG島甲基化的定

5、量檢測(cè)芯片。
　　 為了識(shí)別目的基因中的甲基化和未甲基化的CpG位點(diǎn)，樣品DNA首先用亞硫酸氫鹽處理。目標(biāo)區(qū)域通過PCR擴(kuò)增后，未甲基化的CpG二核苷轉(zhuǎn)化成TpG；同時(shí)甲基化的CpG得到保留。設(shè)計(jì)一對(duì)鎖式探針，其中一條與CpG位點(diǎn)匹配，另一條與TpG匹配。鎖式探針對(duì)與純化的PCR產(chǎn)物雜交，當(dāng)鎖式探針的兩個(gè)末端與PCR產(chǎn)物匹配時(shí)，鎖式探針才能被連結(jié)，并形成RCA反應(yīng)所需的環(huán)狀模版。這樣，通過我們?cè)O(shè)計(jì)的一對(duì)鎖式探針，把原目標(biāo)基因中C

6、pG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的信息用對(duì)應(yīng)的環(huán)狀模版所表述出來(lái)，并在下一步的RCA反應(yīng)中被放大。連結(jié)的鎖式探針與RCA通用引物雜交后，在Φ29DNA聚合酶作用下，通過RCA反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。RCA產(chǎn)物固定在玻片上形成DNA微陣列。DNA微陣列與通用的CY3-CY5雙色探針對(duì)進(jìn)行雜交。而這兩種通用探針分別針對(duì)甲基化和非甲基化而設(shè)計(jì)的，通過雜交產(chǎn)生的兩種熒光強(qiáng)度的比值可以用來(lái)檢測(cè)樣本中的甲基化狀態(tài)。利用這個(gè)方法，我們成功地對(duì)位于P16和IGFBP7基因上的

7、CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了定量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到甲基化特異性PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種RCA產(chǎn)物微陣列有望用于CpG島的甲基化狀態(tài)的定量分析。
　　 3、利用滾環(huán)擴(kuò)增和在片原位鏈替代擴(kuò)增來(lái)平行展示基因組片段。
　　 高通量測(cè)序技術(shù)，要求在一個(gè)芯片大小的面積上，同時(shí)進(jìn)行上百萬(wàn)個(gè)大規(guī)模平行的測(cè)序反應(yīng)以獲得極高的測(cè)序通量。因此只有將上百萬(wàn)個(gè)待測(cè)基因組DNA片段平行地展示于芯片，形成高密度的DNA測(cè)序芯片，才能滿足這種高通量

8、測(cè)序的要求。我們利用Φ29 DNA聚合酶進(jìn)行兩步擴(kuò)增從而在玻片上產(chǎn)生大量的DNA克隆群落，這些克隆群落可以實(shí)現(xiàn)基因組DNA片段在玻片上的平行展示。本研究中，在φ29 DNA聚合酶作用下，基因組DNA片段先以RCA的方式在液相中擴(kuò)增，然后再以鏈替代反應(yīng)的方式在玻片上進(jìn)一步擴(kuò)增。利用這個(gè)方法產(chǎn)生的DNA克隆群落成功地實(shí)現(xiàn)了T7基因組片段在玻片上的平行展示。這些DNA克隆群落可以成功地用雜交或熒光-dNTP進(jìn)行識(shí)別，被展示的DNA片段和背景熒

9、光信號(hào)有明顯的區(qū)別。本方案有較好的重現(xiàn)性，用本方案產(chǎn)生的DNA克隆群落有望用于高通量測(cè)序。
　　 4、利用微流體技術(shù)和磁珠陣列制作高密度測(cè)序芯片。
　　 通過磁珠乳液PCR可以制備出表面帶大量DNA片段克隆的磁珠，這種克隆磁珠已經(jīng)成功用于制備高密度測(cè)序芯片。但現(xiàn)行方案制備的磁珠測(cè)序芯片用于高通量測(cè)序時(shí)，在測(cè)序過程中對(duì)試劑的消耗量非常大。我們?cè)O(shè)計(jì)了微流體芯片，并將帶有DNA片段克隆的磁珠以共價(jià)結(jié)合的方式，固定于微流道中形成