AngⅡ?qū)谒睾铣傻淖饔眉捌錂C(jī)制的研究.pdf

1、皮膚創(chuàng)傷后（燒傷、外傷、有創(chuàng)激光治療等）色素異常在臨床中十分常見(jiàn)，嚴(yán)重影響著患者的生活和心理，也越來(lái)越多的受到社會(huì)的關(guān)注。然而，目前治療創(chuàng)傷后瘢痕性色素異常的療效并不樂(lè)觀，也缺乏防止傷口愈合中這種并發(fā)癥出現(xiàn)的有效策略，對(duì)于臨床醫(yī)生而言面臨著巨大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，盡管很多學(xué)者在創(chuàng)傷愈合及色素細(xì)胞方面進(jìn)行了廣泛研究，但仍未闡明其確切機(jī)制及確定良好的治療措施。
　　創(chuàng)傷后色素異常的產(chǎn)生是十分復(fù)雜的過(guò)程，一般認(rèn)為可能與創(chuàng)傷后皮膚血運(yùn)變化、局部

2、炎癥刺激、理化因素導(dǎo)致局部代謝功能紊亂、黑素細(xì)胞功能受損或喪失等因素有關(guān)。皮膚色素產(chǎn)生及黑素合成受到多基因、多轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控，而影響黑素生物合成的因素還包括很多，如黑素細(xì)胞周圍環(huán)境的物理化學(xué)性質(zhì)改變、體內(nèi)的細(xì)胞因子、多種激素等等。然而，黑素合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因素是酪氨酸酶基因家族，酪氨酸酶是黑素合成中的限速酶，也可以說(shuō)是調(diào)節(jié)黑素合成的開(kāi)關(guān)，起著至關(guān)重要的作用，其主要通過(guò)對(duì)酪氨酸起催化作用，繼而使多巴胺發(fā)生羥化反應(yīng)，多巴醌發(fā)生氧化

3、反應(yīng)，進(jìn)而對(duì)黑素生成進(jìn)行調(diào)控。有研究證實(shí)，酪氨酸酶基因家族蛋白是黑素細(xì)胞特異性蛋白，主要受小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)的調(diào)節(jié)。MITF通過(guò)與酪氨酸酶家族啟動(dòng)子中的特殊部位結(jié)合后，一方面可指導(dǎo)TRY和TRP-1在黑素細(xì)胞中特異性表達(dá)，另一方面可刺激啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而對(duì)黑素細(xì)胞黑素生成進(jìn)行調(diào)控。因而，MITF在黑素合成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。多年來(lái)，在黑素細(xì)胞生物學(xué)作用的研究中，黑素生成的信號(hào)通路在黑素細(xì)胞的研究中也一直受到廣泛的關(guān)注

4、，有研究發(fā)現(xiàn)，在黑素合成過(guò)程中，兩條重要的信號(hào)通路發(fā)揮著非常重要作用，分別是蛋白激酶A(PKA)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑，而還有其他許多信號(hào)通路也存在并參與著黑素的合成，他們之間并不是孤立存在的，而是有著密切關(guān)聯(lián)性的。在黑素細(xì)胞的研究中，已證實(shí)，MITF可通過(guò)調(diào)控cAMP增高，促使PKC-β的表達(dá)，繼而使PKC與cAMP途徑共同結(jié)合達(dá)到協(xié)同效應(yīng)。這種信號(hào)途徑之間的網(wǎng)絡(luò)狀信號(hào)交聯(lián)可擴(kuò)大黑素生成作用的效應(yīng)。
　　皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一

5、個(gè)復(fù)雜而多步驟的過(guò)程，也是導(dǎo)致皮膚色素改變的重要誘因之一，修復(fù)過(guò)程可涉及到炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，細(xì)胞的增殖遷移等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究表明在損傷修復(fù)過(guò)程中，AngⅡ幾乎涉及到了創(chuàng)傷愈合中的每個(gè)步驟。多項(xiàng)研究證明AngⅡ在局部皮膚組織中可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分裂、增殖從而加速皮膚創(chuàng)面愈合，也可通過(guò)增加血管通透性和炎癥細(xì)胞的趨化作用，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。AngⅡ可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，可通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞而合成細(xì)胞外基質(zhì)成分，可通過(guò)AT1受體促

6、進(jìn)膠原合成，還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖等等，均證明AngⅡ在創(chuàng)傷愈合中的重要作用。以往研究表明，在黑素瘤細(xì)胞和痣細(xì)胞上都被證實(shí)有AngⅡ受體的表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AngⅡ AT1受體的抑制限制了鼠黑素瘤的生長(zhǎng)，并已有學(xué)者研究在分離的人黑素細(xì)胞中AT1受體和AT2受體mRNA水平表達(dá)情況，結(jié)果證明在培養(yǎng)的原始黑素細(xì)胞中，存在AngⅡ AT1受體的表達(dá)，而并沒(méi)有AT2受體的表達(dá)。
　　雖然許多研究表明AngⅡ在損傷修復(fù)中的各種功能

7、，但AngⅡ是否在傷口愈合過(guò)程中可調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞系統(tǒng)而影響皮膚的色素變化尚是未知的研究領(lǐng)域。因此我們提出了問(wèn)題并探索AngⅡ在人類黑色素細(xì)胞中的作用。
　　本課題將以AngⅡ?yàn)檠芯磕繕?biāo)，從研究其對(duì)黑素細(xì)胞中黑素細(xì)胞增殖和黑素合成著手，繼而對(duì)AngⅡ?qū)谒丶?xì)胞中AT1受體的表達(dá)調(diào)節(jié)作用進(jìn)行分析，然后從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面對(duì)AngⅡ促黑素合成作用進(jìn)行深入研究。通過(guò)這一原創(chuàng)性研究，我們可望初步探討AngⅡ?qū)θ撕谒丶?xì)胞黑素合成的影響，加深理解

8、AngⅡ調(diào)控黑素合成的分子和細(xì)胞機(jī)制，以期為進(jìn)一步了解創(chuàng)傷修復(fù)后色素異常的機(jī)制而尋求新的治療靶點(diǎn)及途徑。本課題研究?jī)?nèi)容主要包括三部分:
　　第一部分 AngⅡ?qū)θ撕谒丶?xì)胞黑素合成及遷移的影響
　　方法:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM濃度的AngⅡ分別作用于黑素細(xì)胞24小時(shí)后，用噻唑藍(lán)比色法(MTT比色法)測(cè)定細(xì)胞的活性。通過(guò)NaOH溶解法、酪氨酸酶活性分析測(cè)定黑素含量和酪氨酸酶

9、活性。通過(guò)細(xì)胞膜濾過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)AngⅡ?qū)谒丶?xì)胞遷移活性的影響。
　　結(jié)果:與空白組比較，AngⅡ?qū)?xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P＞0.05)。AngⅡ作用于黑素細(xì)胞24小時(shí)后，與空白對(duì)照組比較，在0.1～100 nM AngⅡ范圍內(nèi)酪氨酸酶活性呈劑量依賴方式明顯遞增，在10～100 nM范圍內(nèi)對(duì)黑素合成有明顯促進(jìn)作用(P＜0.05)，而在100 nM AngⅡ濃度時(shí)的作用均達(dá)到最強(qiáng)(P＜0.01)。而0.01 nM濃度的AngⅡ，對(duì)

10、酪氨酸酶活性沒(méi)有影響;在0.01～1 nM范圍內(nèi)AngⅡ?qū)谒睾铣蔁o(wú)顯著作用(P＞0.05)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則顯示100 nM AngⅡ較空白對(duì)照組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:AngⅡ?qū)谒丶?xì)胞增殖無(wú)明顯影響，可能與本實(shí)驗(yàn)中孵育濃度及時(shí)間有限有關(guān);AngⅡ可促進(jìn)黑素細(xì)胞黑素的合成及促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移。
　　第二部分 AngⅡ?qū)θ撕谒丶?xì)胞中AT1受體及酪氨酸酶活性和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　方法:用

11、100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM濃度的AngⅡ分別作用于黑素細(xì)胞24小時(shí)后，應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot的方法，檢測(cè)不同濃度下AT1受體及酪氨酸酶mRNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)。同時(shí)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取AT1受體拮抗劑1000 nM LOS干預(yù)黑素細(xì)胞后，檢測(cè)AT1受體及酪氨酸酶的mRNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)變化情況，以及對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響情況。
　　結(jié)果:在0.1～100 n

12、M濃度范圍內(nèi)，AngⅡ?qū)θ撕谒丶?xì)胞中AT1受體及酪氨酸酶的mRNA和蛋白水平都有不同程度的上調(diào)作用;而這些作用，均可被AngⅡ AT1受體拮抗劑LOS所抑制。通過(guò)細(xì)胞膜濾過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LOS并不能抑制AngⅡ?qū)谒丶?xì)胞的促遷移效應(yīng)。
　　結(jié)論:AT1受體可介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)黑素細(xì)胞中酪氨酸酶的增加，其可能與酪氨酸酶信號(hào)密切相關(guān);AngⅡ可經(jīng)AT1受體調(diào)節(jié)促進(jìn)黑素合成作用，但并不經(jīng)AT1受體促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移效應(yīng)。
　　第

13、三部分 MITF和PKC參與AngⅡ?qū)θ撕谒丶?xì)胞酪氨酸酶及黑素合成作用的調(diào)節(jié)
　　方法:按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將不同濃度的AngⅡ與培養(yǎng)的黑素細(xì)胞處理后，用RT-PCR和Western blot方法對(duì)MITF mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。而后選擇特異性的PKA抑制劑H89和特異性的PKC抑制劑Ro-32-0432處理黑素細(xì)胞1小時(shí)后，加入100 nM濃度的AngⅡ孵育黑素細(xì)胞24小時(shí)，對(duì)黑素合成含量進(jìn)行檢測(cè)。再據(jù)此結(jié)果，選取100nM的Ang

14、Ⅱ和PKC抑制劑Ro-32-0432共同作用于黑素細(xì)胞后通過(guò)RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)酪氨酸酶mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化。用ELESIA方法檢測(cè)AngⅡ作用后黑素細(xì)胞中PKC活性的變化。
　　結(jié)果:AngⅡ可上調(diào)黑素細(xì)胞內(nèi)MITF及酪氨酸酶的mRNA和蛋白水平。當(dāng)選擇性抑制PKC途徑時(shí)，可逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)黑素合成、上調(diào)酪氨酸酶mRNA及蛋白表達(dá)的作用，而PKA途徑受到抑制后，AngⅡ的這些作用并沒(méi)有受到抑制。

15、用ELESIA的方法檢測(cè)出AngⅡ作用后黑素細(xì)胞中PKC活性明顯增加。
　　結(jié)論:AngⅡ上調(diào)酪氨酸酶的表達(dá)促進(jìn)黑素合成的作用一方面可能與調(diào)節(jié)MITF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有關(guān)，另一方面可能與激活PKC途徑有關(guān)。
　　綜上所述，AngⅡ可促進(jìn)人黑素細(xì)胞的黑素合成，而其作用可能通過(guò)AT1受體調(diào)節(jié)酪氨酸酶活性而發(fā)揮效應(yīng)，而MITF、PKC也是參與AngⅡ促進(jìn)人黑素細(xì)胞黑素合成過(guò)程中的重要因素。值得注意的是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次對(duì)AngⅡ?qū)谒丶?xì)胞