海水養(yǎng)殖環(huán)境蛭弧菌類(lèi)生物多樣性及噬菌弧菌DA5對(duì)細(xì)菌的生物控制.pdf

1、蛭弧菌類(lèi)生物(Bdellovibrio—and—like organisms，BALOs)，是一類(lèi)以裂解其它革蘭氏陰性菌為生的小型寄生性細(xì)菌，普遍存在于自然和人工生境中，對(duì)環(huán)境細(xì)菌的群體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)可能具有重要影響，在有害細(xì)菌的生物控制上具有潛在應(yīng)用價(jià)值。 本論文首先通過(guò)分離培養(yǎng)結(jié)合分子分型和系統(tǒng)鑒定，對(duì)廣東省湛江市海水養(yǎng)殖較集中的東海島和南三島蝦池及其近岸海水BALOs進(jìn)行了較系統(tǒng)調(diào)查。結(jié)果顯示以溶藻弧菌(Vibrio alg

2、inolyticus)zouA(zouA)為宿主菌，雙層平板計(jì)數(shù)蝦池及其近岸表層海水BALOs含量為47-1238 pfu/mL，且BALOs含量與異養(yǎng)細(xì)菌含量呈正相關(guān)。本研究首次將PCR—變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)用于二元培養(yǎng)狀態(tài)下BALOs的直接分型，并通過(guò)靶向16S rDNA V3區(qū)PCR—DGGE和噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)

3、特異的16S rDNA擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(amplified rDNA restriction analysis，ARDRA)將130株BALOs分離物分別區(qū)分為五種和四種種系型(phylotype)。系統(tǒng)分析表明本研究所有BALOs分離物均屬于噬菌弧菌科噬菌弧菌屬(Bacteriovorax)，但包含在四個(gè)不同的類(lèi)群(cluster)(Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ)，且兩種分型方法給出的結(jié)果在類(lèi)群水平上完全一致。類(lèi)群Ⅸ菌株在所有水樣中都有分

4、離到，并且是130株分離物中的最優(yōu)勢(shì)類(lèi)型(40.8％)；類(lèi)群Ⅹ菌株除在蝦池NF樣品中未檢測(cè)到外，也普遍存在于各水樣中；類(lèi)群Ⅳ菌株則從所有鹽度相對(duì)較低(<25‰)的水樣中被優(yōu)勢(shì)分離；而類(lèi)群Ⅵ的兩個(gè)分離物僅從一個(gè)赫度最低(8.26‰)的蝦池中獲得。 對(duì)上述四個(gè)類(lèi)群12株代表性BALOs菌株的生長(zhǎng)溫度和鹽度以及對(duì)六種常見(jiàn)對(duì)蝦病原弧菌的裂解能力進(jìn)行了研究，并通過(guò)透射電子顯微鏡分析了其中四個(gè)代表菌株的形態(tài)特征。結(jié)果表明，同一類(lèi)群或亞群內(nèi)菌

5、株的生長(zhǎng)溫度或鹽度范圍相同，即類(lèi)群Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅹ菌株的生長(zhǎng)溫度范圍分別為20℃—35℃、15℃—35℃、15℃—40℃、10℃—40℃，最適生長(zhǎng)溫度都約為30℃或35℃；生長(zhǎng)鹽度范圍分別為5‰—40‰、2.5‰—30‰、5‰—60‰和5‰—60‰，最適生長(zhǎng)鹽度分別約為10‰、5‰、20‰和20‰。被測(cè)的六種弧菌中有三種可被全部12株BALOs裂解，而其它弧菌僅被部分BALOs裂解，但即使同一類(lèi)群菌株，對(duì)某些弧菌也表現(xiàn)不同的裂解能力。形態(tài)

6、上，四株不同類(lèi)群BALOs均呈典型的弧狀細(xì)胞，具極生單鞭毛。 首次通過(guò)不依賴(lài)培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)對(duì)海水養(yǎng)殖環(huán)境BALOs多樣性進(jìn)行了研究。采用特異16S rRNA基因引物分別構(gòu)建了湛江市鄰近東海堤四個(gè)蝦池表層水樣噬菌弧菌和吞菌弧菌(Peredibacter)16S rRNA基因文庫(kù)，并結(jié)合ARDRA分型和測(cè)序，分析了兩大類(lèi)型BALOs的系統(tǒng)發(fā)育。結(jié)果表明海水蝦池中普遍存在高度多樣的噬菌弧菌和吞菌弧菌。以16S rRNA基因序列相

7、似性97％作為界定BALOs類(lèi)群或潛在“種”的標(biāo)準(zhǔn)，本研究四個(gè)噬菌弧菌總文庫(kù)共包括33個(gè)類(lèi)群，其中27個(gè)為首次報(bào)道的新類(lèi)群；僅有四個(gè)類(lèi)群(Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ)屬于已知可培養(yǎng)噬菌弧菌類(lèi)群，但它們的克隆數(shù)則占總文庫(kù)的一半，且類(lèi)群Ⅸ和Ⅺ克隆分別為最優(yōu)勢(shì)(占36.7％)和第二優(yōu)勢(shì)(占9.9％)類(lèi)群。除了一個(gè)含有可培養(yǎng)吞菌弧菌的類(lèi)群(P.starrii A3.12)外，本研究吞菌弧菌總文庫(kù)15個(gè)類(lèi)群中的14個(gè)為首次報(bào)道的新類(lèi)群。系統(tǒng)分析顯示噬菌弧菌和

8、吞菌弧菌彼此互為最緊鄰的分支，并作為一個(gè)整體與蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)親緣關(guān)系最近，而與δ—變形細(xì)菌(δ—proteobacteria)中其它科相距較遠(yuǎn)，但兩者間的序列差異也大于10％。同一水樣噬菌弧菌和吞菌弧菌間種群多樣性可能表現(xiàn)一定程度的競(jìng)爭(zhēng)或排斥，但四個(gè)水樣間總的BALOs多樣性大小較一致。 為了解海洋BALOs對(duì)海水養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌的生物控制效果及其影響因素，選擇噬菌弧菌菌株DA5為代表分別研究了DA

9、5對(duì)海水中單一宿主菌zouA的裂解作用，對(duì)添加營(yíng)養(yǎng)的自然海水中細(xì)菌含量和幾種水體理化指標(biāo)的影響，以及DA5對(duì)zouA感染凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)幼體的試驗(yàn)性治療效果。結(jié)果表明，DA5對(duì)海水中zouA的最適裂解溫度和鹽度范圍分別為30℃—35℃和20‰—30‰，提高通氣或初始感染復(fù)數(shù)有利于DA5快速裂解zouA。適宜條件下，DA5在較短時(shí)間(12 h)內(nèi)可降低海水中zouA含量?jī)蓚€(gè)數(shù)量級(jí)，但較長(zhǎng)時(shí)間(15 d

10、)也不能完全清除宿主細(xì)胞；DA5對(duì)自然海水中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌均有一定的清除作用，且對(duì)弧菌的消減效果更明顯，但對(duì)水體pH、化學(xué)需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)和亞硝酸氮(NO2-N)含量均無(wú)顯著影響；以不同濃度DA5攻擊期細(xì)胞處理時(shí)，較高含量的DA5可減少或顯著減少對(duì)蝦幼體感染zouA的死亡率。 為評(píng)估DA5在無(wú)明顯病害出現(xiàn)情況下對(duì)對(duì)蝦育苗水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響和對(duì)細(xì)菌性病害可能的預(yù)防作用，研究了DA5以?xún)煞N不同濃度(初始水體含

11、量4550和455 pfu/mL)加入凡納濱對(duì)蝦育苗水體后，對(duì)溞狀幼體期間水體細(xì)菌含量和種群結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)幼體存活率的影響以及對(duì)水體理化指標(biāo)的影響。平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示高濃度DA5較短時(shí)間內(nèi)(12h)對(duì)育苗水體異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌含量均具有較明顯消減作用，但DGGE分析表明本研究條件下DA5對(duì)水體優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)影響不明顯，可能僅對(duì)極少數(shù)非優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)具有調(diào)控作用；高含量DA5一定程度上具有促進(jìn)幼體存活的作用，而低濃度DA5則無(wú)明顯作用。試驗(yàn)

12、期間DA5處理組和對(duì)照組間水體pH、COD、溶解氧、NH3-N和NO2-N含量均無(wú)顯著差異。 本研究最后采用經(jīng)典培養(yǎng)法結(jié)合PCR基礎(chǔ)的分子檢測(cè)，首次系統(tǒng)報(bào)道了商品化BALOs制劑的質(zhì)量。結(jié)果表明被檢測(cè)的八個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖用BALOs制劑中有六個(gè)質(zhì)量明顯不合格，僅兩個(gè)樣品被蛭弧菌科特異引物檢測(cè)為陽(yáng)性，被雙層平板證實(shí)有噬斑出現(xiàn)。其中一個(gè)樣品中存在兩種形態(tài)和宿主范圍不同的噬斑分離物，且不同宿主菌計(jì)數(shù)結(jié)果存在明顯差異。16S rRNA基因序列