小鼠哮喘模型Rac1水平的改變及其與ILC2相關細胞因子的關系.pdf

1、目的：
　　通過建立小鼠哮喘模型，檢測Rac1在小鼠哮喘模型前后相關組織中表達水平的改變情況，并分析Rac1與2型固有淋巴細胞（ILC2）相關細胞因子如IL-5、IL-33、IL-13表達的關系，觀察其對氣道炎癥的影響，探討Rac1調節(jié)免疫應答反應類型和參與哮喘病理損傷的可能機制，為進一步深入研究哮喘病的發(fā)病機制奠定基礎，拓展哮喘病臨床干預的新思路。
　　方法：
　　1.卵清蛋白（OVA）哮喘模型的建立：哮喘建模參照文

2、獻并稍加改進，即實驗組小鼠在第1d和第11d分別腹腔注射50μg OVA和10％氫氧化鋁佐劑，對照組注射相等量的生理鹽水(NS)，第22d開始實驗組各小鼠給予霧化吸入2%的OVA與生理鹽水的混合溶液,激發(fā)小鼠的I型超敏反應,1次1小時,每天霧化1次、一連5d。同時，正常組小鼠給予吸入相等的NS。
　　2. Rac1抑制劑（EHT1864）干預試驗：在建模過程中，于霧化前三天連續(xù)給小鼠腹腔注射EHT1864，其他步驟同上述哮喘模型建

3、立。EHT1864粉劑在使用前用生理鹽水溶解并充分混勻，用藥量為40mg\kg。
　　3.定量-PCR檢測mRNA：取小鼠支氣管肺泡灌洗、外周血單個核細胞，經離心獲得細胞沉淀；取左邊肺組織，充分剪碎研磨得到組織懸液。于上述細胞或組織懸液加入Trizol以裂解細胞并獲取總RNA，然后再進行逆轉錄反應合成cDNA。繼而做實時熒光定量PCR，檢測Rac1及ILC2相關細胞因子（IL-5, IL-33和IL-13） mRNA的表達。

4、>　　4.酶聯免疫吸附試驗：取小鼠的支氣管肺泡灌洗液（BALF）或眼球外周血，經離心后得到灌洗液上清和外周血血清，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法檢測ILC2相關的細胞因子（IL-5, IL-33和IL-13）蛋白表達水平。
　　5.組織切片病理觀察：取小鼠右肺組織置于福爾馬林中經固定、石蠟包埋等一系列過程制成切片，蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察病理表現。
　　6.熒光抗體染色：取小鼠支氣管置于福爾馬林中經固定、石

5、蠟包埋等一系列過程制作成石蠟切片，再用直接法進行免疫熒光抗體染色，檢測支氣管中Rac1的表達情況。
　　7.采用Graph Pad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析：對哮喘小鼠肺組織Rac1和細胞因子（IL-5, IL-33和IL-13）的表達水平進行直線相關分析，組間均數比較采用兩樣本非配對T檢驗,相關性分析選用Pearson法，P<0.05，表明差異有統(tǒng)計學意義，多組間的統(tǒng)計分析采用0ne-way ANOVA，P<0.05，表明差

6、異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.通過哮喘模型制作過程對小鼠的觀察可見，哮喘組小鼠表現為煩躁不安,出現頻繁瘙癢的行為，同時還伴有呼吸加深加快、打噴嚏、大小便失禁、擤鼻等典型的哮喘表現，而對照組無明顯異常表現。
　　2.肺組織病理觀察結果:HE染色顯微鏡下可見，哮喘組小鼠肺泡間及周圍小血管出現大量炎癥細胞，如嗜酸性粒細胞浸潤、氣道內杯狀細胞肥大增生、血清總IgE及OVA-IgE含量均高于對照組。而對照組小鼠可見，肺組

7、織氣道結構清晰、氣管周圍無細胞浸潤、炎癥性改變不明顯。
　　3.免疫熒光分析表明：哮喘模型小鼠Rac1的水平與正常小鼠相比顯著下降， EHT1864干預后，Rac1的表達進一步下調。
　　4.定量RT-PCR分析結果：哮喘小鼠肺組織或肺泡灌洗液Rac1 mRNA表達水平均明顯低于正常對照組，使用EHT1864干預后，Rac1水平則進一步降低。
　　5.小鼠肺組織表達ILC2相關細胞因子的檢測：通過分析模型組與正常組目的

8、基因mRNA表達水平，結果顯示，哮喘小鼠肺組織的IL-5、IL-33和IL-13的水平與正常組小鼠相比均顯著增高；EHT1864處理組的IL-5、IL-33和IL-13的水平上調尤為顯著。此結果表明Rac1的降低與ILC2相關細胞因子水平的升高存在著緊密的聯系。
　　6. ELISA檢測外周血上清IL-5、IL-33和IL-13蛋白表達水平的結果表明，哮喘模型組小鼠上述細胞因子水平均高于對照組。
　　7.分析肺組織中Rac1

9、與IL-5、IL-33和IL-13mRNA表達水平關系的相關性結果顯示，哮喘小鼠肺組織Rac1的mRNA水平與IL-5、IL-33和IL-13的mRNA水平均顯示明顯的負相關。
　　結論：
　　在哮喘小鼠，IL-5、IL-33和IL-13的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比都顯著增高，同時Rac1的表達卻顯著下降。相關性分析表明Rac1和ILC2s相關細胞因子(IL-5,IL-33，IL-13)之間存在顯著地負相關。為了進一