桔青霉素人工抗原合成鑒定和卵黃抗體制備及檢測(cè)方法研究.pdf

1、桔青霉素(Citrinin，CTN)是青霉屬和曲霉屬等某些真菌菌株產(chǎn)生的真菌毒素，分子式是C13H14O5，分子量為250，其化學(xué)命名為(3R，4S)—4，6-二氫—8-羥基—3，4，5-三甲基—6-氧—3H—2-苯吡—7羧酸。桔青霉素具有良好的抑菌性，能抑制芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、結(jié)核分枝桿菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，還能抗某些真菌和原生動(dòng)物，對(duì)革蘭氏陰性菌抑制弱。但是桔青霉素能引起許多動(dòng)物的腎臟毒害，并有致癌性，

2、因?yàn)榻矍嗝顾氐倪@些特性，近年來(lái)桔青霉素污染引發(fā)的包括對(duì)人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的毒害問(wèn)題，越來(lái)越引起人們的關(guān)注。 桔青霉素的檢測(cè)方法有多種，目前測(cè)定桔青霉素的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法和免疫化學(xué)方法。其中免疫化學(xué)方法由于具有較高的靈敏度和特異性、對(duì)樣品的純度要求不高、特別適合于大批量樣本的檢測(cè)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于各種真菌毒素的檢測(cè)。免疫化學(xué)方法必須以抗體為基礎(chǔ)，若要提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，關(guān)鍵是要得到對(duì)桔青霉素具有高度特

3、異性和親和力的抗體。Abramson等報(bào)道，用多克隆抗體研制的ELISA試劑可用于檢測(cè)桔青霉素；2007年，劉仁榮制備桔青霉素的單克隆抗體，并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法。 但是迄今為止，全世界仍未能制訂桔青霉素檢測(cè)的統(tǒng)一方法和標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)現(xiàn)在還沒(méi)有建立測(cè)定桔青霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法。其主要原因是不同國(guó)家采取的方法和標(biāo)準(zhǔn)各不相同，缺乏行之有效的分析檢測(cè)方法。為了保護(hù)公眾健康，必須盡快建立更加靈敏、精確、方便操作的桔青霉素檢測(cè)分析方法

4、，并制定統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)槁腰S抗體IgY的運(yùn)用越來(lái)越廣泛，但是，到目前仍沒(méi)有利用卵黃抗體IgY建立檢測(cè)桔青霉素的相關(guān)方法，本研究通過(guò)制備桔青霉素人工抗原免疫萊亨雞，獲得桔青霉素卵黃抗體IgY，并建立ELISA分析方法和膠體金方法，進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。 研究方法 第一部分，桔青霉素人工抗原的合成與鑒定。采用甲醛加成法，制備并獲得桔青霉素—小牛血清白蛋白(CTN—BSA)結(jié)合物，10000rpm離心15分鐘去除沉淀，然后—60

5、℃真空抽干，得到CTN—BSA產(chǎn)物；用同樣的方法，得到CTN與OVA偶聯(lián)物，即桔青霉素—卵清蛋白結(jié)合抗原CTN—OVA，最后進(jìn)行真空抽干，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?用波長(zhǎng)為240nm—400nm紫外光譜分析方法，對(duì)CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA同時(shí)進(jìn)行掃描分析；并使用紅外線光譜法對(duì)以上物質(zhì)進(jìn)行掃描分析；同時(shí)對(duì)合成抗原經(jīng)過(guò)SDS—PAGE電泳鑒定。 第二部分，制備和純化桔青霉素抗體IgY。使用人工合成

6、抗原CTN—BSA免疫產(chǎn)卵期白萊亨雞，第一次每只雞注射1.0ml乳化抗原加完全弗氏佐劑，然后進(jìn)行4輪半量乳化抗原加不完全弗氏佐劑的加強(qiáng)免疫注射，收集免疫后產(chǎn)卵，同時(shí)留取免疫前產(chǎn)卵作為陰性對(duì)照。 采用優(yōu)化的Clarke方法進(jìn)行桔青霉素卵黃抗體IgY純化，用3體積4％的聚乙二醇6000溶液和3體積氯仿，稀釋1體積卵黃，共進(jìn)行兩次沉淀，獲得桔青霉素卵黃抗體IgY，然后在—60℃條件下進(jìn)行真空抽干，產(chǎn)物置于—20℃保存?zhèn)溆谩?使

7、用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳方法(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)，進(jìn)行桔青霉素卵黃抗體IgY鑒定。 采用ELISA檢測(cè)法的方陣滴定，測(cè)定桔青霉素卵黃抗體IgY效價(jià)，用免疫前卵清蛋白作為陰性對(duì)照，確定檢測(cè)抗體的最大稀釋度。 桔青霉素抗體IgY穩(wěn)定性試驗(yàn)：(1)IgY熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，將IgY用PBS稀釋成1mg/ml，分別在

8、20℃～80℃水浴內(nèi)處理20min，采用ELISA方法測(cè)定其吸光度值，檢測(cè)活性；另外分2組65℃水浴30分鐘、72℃15秒進(jìn)行巴氏消毒，ELISA測(cè)定活性；(2)pH試驗(yàn)，在pH值為1～12的條件下，37℃孵育2小時(shí)后ELISA測(cè)定活性；(3)胃蛋白酶試驗(yàn)，將胃蛋白酶按1:3000進(jìn)行稀釋，用pH4.0的0.05mol/LTris—C1緩沖液將IgY稀釋成1mg/ml，在100μlIgY稀釋液中分別加入10μl上述胃蛋白酶溶液，37℃分

9、別作用1～8小時(shí)后，ELISA測(cè)定活性；(4)胰蛋白酶試驗(yàn)：將胰蛋白酶銨1:400稀釋，用PBS將桔青霉素IgY濃度稀釋至1mg/ml，調(diào)整反應(yīng)pH為8.0，37℃分別反應(yīng)1～4h，ELISA測(cè)定活性；(5)凍融處理：冰凍于—20℃，融化于4℃，反復(fù)凍融5次，ELISA測(cè)定活性。 桔青霉素抗體IgY的特異性檢測(cè)，采用ELISA試驗(yàn)檢測(cè)桔青霉素，同時(shí)檢測(cè)OTA，AFB1，PAT，DON和ZON，檢測(cè)桔青霉素卵黃抗體IgY特異性。

10、 第三部分，檢測(cè)桔青霉素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立和應(yīng)用評(píng)價(jià)。使用ELISA方陣滴定法，確定最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋度；同樣確定最佳酶標(biāo)記二抗稀釋度；建立檢測(cè)桔青霉素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其檢測(cè)限和線性范圍，并且將間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和高效液相色譜法(HPLC)，進(jìn)行檢測(cè)桔青霉素的相關(guān)性研究，相關(guān)系數(shù)為r=0.9896；然后進(jìn)行樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)、酶標(biāo)板均一性檢測(cè)，平均吸光度值為A：1.357，變異系數(shù)(CV

11、)為：3.896％，評(píng)價(jià)間接競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA檢測(cè)方法結(jié)果較好。 第四部分，建立膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)桔青霉素方法以及初步應(yīng)用。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；取制備好的膠體金溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定制備的膠體金的最大吸收峰值，用透射電鏡掃描測(cè)定制備的膠體會(huì)的形狀，以判斷膠體金制備效果；利用10％氯化鈉加入，并用分光光度計(jì)測(cè)其在580nm處的吸光度值，測(cè)得膠體金標(biāo)記抗體的最小用量，然后計(jì)算出膠體金標(biāo)記抗體最適穩(wěn)定量；利用波長(zhǎng)580

12、nm條件下測(cè)定吸光度值，選定膠體金標(biāo)記抗體時(shí)的最佳pH值；采用低溫超速離心法純化膠體金標(biāo)記抗體，以除去其中未標(biāo)記的抗體和未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。 優(yōu)化試驗(yàn)步驟，建立競(jìng)爭(zhēng)法膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)桔青霉素方法，鑒定其特性，包括確定其檢測(cè)限為20ng/ml，將膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)桔青霉素方法與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行相關(guān)性比較；然后檢測(cè)試制膠體金檢測(cè)試紙條的性能。 主要研究結(jié)果 1、成功完成桔

13、青霉素人工抗原合成與鑒定 使用紫外光譜分析方法和紅外線光譜法，分別對(duì)CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA進(jìn)行鑒定分析；由紫外線光譜鑒定圖和紅外線光譜鑒定圖；以及對(duì)合成抗原經(jīng)過(guò)SDS—PAGE電泳鑒定的實(shí)驗(yàn)證明，采用甲醛加成法的人工免疫抗原CTN—BSA和檢測(cè)用包被抗原CTN—OVA成功合成。 2、通過(guò)免疫過(guò)程，制備和純化桔青霉素卵黃抗體IgY，并進(jìn)行抗體鑒定和特異性檢測(cè) 用ELISA方法測(cè)定桔青

14、霉素卵黃抗體IgY的效價(jià)結(jié)果顯示，桔青霉素人工抗原免疫效果明顯，桔青霉素卵黃抗體IgY的最高效價(jià)為1:102400，表明免疫的CTN人工抗原免疫刺激白萊亨雞產(chǎn)生了針對(duì)CTN的較高的滴度特異性抗體。 桔青霉素抗體IgY的凝膠電泳(SDS—PAGE)鑒定結(jié)果顯示，通過(guò)制備得到最終較純的桔青霉素卵黃抗體IgY；桔青霉素IgY抗體特異性測(cè)試結(jié)果表明，當(dāng)濃度達(dá)到10，000ng/ml時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)與固定抗原表面決定簇產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)交叉反應(yīng)的其它毒素

15、(OTA，AFB1，PAT，DON和ZON)，證明獲得了特異性強(qiáng)的桔青霉素卵黃抗體IgY。 3、利用制備和純化桔青霉素卵黃抗體IgY，建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測(cè)桔青霉素 使用ELISA方陣滴定法，用確定最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋度，最佳包被抗原濃度為CTN—OVA10μg/ml，枯青霉素卵黃抗體IgY最大檢測(cè)靈敏度的效價(jià)為1:256，同樣方法確定最佳酶標(biāo)記二抗稀釋度為1:500。 建立檢測(cè)桔青霉素的

16、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其檢測(cè)限10ng/ml，和線性范圍為20～640ng/ml；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法和高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)桔青霉素的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為r=0.9896；樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的平均的回收率為94.47％，平均變異系數(shù)為4.917％；酶標(biāo)板均一性檢測(cè)的平均變異系數(shù)為3.896％。 4、利用免疫膠體金結(jié)合桔青霉素卵黃抗體IgY，建立膠體金檢測(cè)桔青霉素方法以及初步應(yīng)用 采用檸檬酸三鈉還

17、原法成功制備40nm左右膠體金；紫外分光光度計(jì)測(cè)定和透射電鏡掃描測(cè)定制備的膠體金的形狀，顯示膠體金制備效果較好；測(cè)得膠體會(huì)標(biāo)記抗體最適穩(wěn)定量為45ug/ml；選定的膠體金標(biāo)記抗體時(shí)的最佳pH值為8.5。 優(yōu)化試驗(yàn)步驟，建立了競(jìng)爭(zhēng)法膠體金標(biāo)記抗體檢測(cè)桔青霉素方法，其檢測(cè)限20ng/ml，膠體會(huì)標(biāo)記抗體檢測(cè)桔青霉素方法與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的符合率為97.0％；膠體金檢測(cè)試紙條的性能檢測(cè)顯示試紙條保存期可大于6個(gè)月。 結(jié)論：