BMP4信號通路與KLF4在Barrett食管形成中的作用研究.pdf

1、目的:
　　Barrett食管是一種食管黏膜化生性病變，即遠端正常食管鱗狀上皮被柱狀上皮取代的病變?，F(xiàn)在認為，以膽汁酸反流為特征的反流性胃食管病是BE發(fā)生的主要風險因素。反流的膽汁酸能夠?qū)е吗つど掀さ穆匝装Y和損傷，通過一系列分子生物學事件進而導致正常食管上皮向BE的轉(zhuǎn)化，甚至最終導致食管腺癌的發(fā)生。然而，食管鱗狀上皮向柱狀上皮轉(zhuǎn)化過程中的分子事件目前仍不清楚。
　　有學者通過基因表達的系列分析對比BE和正常食管黏膜中各基因

2、的表達差異，試圖找出涉及正常食管上皮向BE的轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bonemorphogenetic protein4，BMP4)被檢測到僅在BE中高表達而不表達于正常食管黏膜。BMP4信號通路下游還包括BMP4受體，p-Smad1/5/8和Smad4。它們共同組成了BMP4信號通路。p-Smad1/5/8蛋白能與Smad4形成復(fù)合體轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，進而參與調(diào)控某些目的基因。BMP4信號通路在細胞增殖，組織分化和胚胎發(fā)育中都起著

3、至關(guān)重要的作用。一些研究表明BMP4信號通路也可能參與食管鱗狀上皮向BE的轉(zhuǎn)化過程。
　　Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子4是一類鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子。其廣泛存在于各種器官組織中，參與調(diào)解細胞增殖，早起胚胎發(fā)育以及凋亡。KLF4在腫瘤形成和誘導多能干細胞中的作用被廣泛研究，作用非常重要?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們猜想BMP4和KLF4可能共同參與促進DCA誘導的食管黏膜化生。
　　方法:
　　1.選取西南醫(yī)院2012年3-12月

4、的71例消化內(nèi)科門診患者，簽署知情同意書后，按照正常和BE分組取活檢組織標本，所有新鮮組織塊用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4μm薄片貼在載玻片。
　　2.飼養(yǎng)SD大鼠，制作大鼠BE模型，模型完成后按照正常和BE分組取活檢組織標本，所有新鮮組織塊用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4μm薄片貼在載玻片。
　　3.制作正常食管組織和BE組織石蠟標本，切片。免疫組化SP法染色檢測所有組織標本中各蛋白表達水平，染色、封片、閱片

5、處理。利用SPSS18.0軟件進行對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比較它們之間的關(guān)系。
　　4.用BEBM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HET-1A、TE-1和OE33細胞。用200μmol/L的DCA，分別處理體外培養(yǎng)的細胞4、8、12h。
　　5.以GeneBank收錄的KLF4基因序列作為分析序列，設(shè)計siRNA干擾序列，將稀釋的羅氏轉(zhuǎn)染試劑與稀釋的siRNA輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，以形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物，對體外培養(yǎng)的細胞

6、進行干擾實驗。
　　6.載有卡那霉素固體培養(yǎng)基培養(yǎng)載有KLF4序列的細菌，接種環(huán)火上灼燒冷卻后蘸取質(zhì)粒菌液，按照“Z”字形劃板。半小時后將培養(yǎng)板倒置放在細菌孵箱14小時繼續(xù)培養(yǎng)。
　　7.按照美國Sigma公司說明書，洗滌、離心、分離、濃縮、裂解、抽提質(zhì)粒。
　　8.構(gòu)建LV-KLF4重組慢病毒，利用polybrene提高轉(zhuǎn)染效率，將稀釋液再與Enhanced Infection Solution混合均勻，加入進體外培

7、養(yǎng)的細胞中，對KLF4基因進行過表達。熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，等熒光穩(wěn)定后開始用嘌呤霉素篩選。
　　9.使用添加外源性BMP4和Noggin對BMP4信號進行激活或抑制，檢測下游分子的表達變化。
　　10.利用特異性單克隆一抗孵育處理后的細胞，用載有熒光標記的二抗結(jié)合一抗，再用激光共聚焦細胞免疫熒光檢測細胞中各基因的變化。
　　11.使用qRT-PCR和Western blotting方法檢測各

8、種處理組基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.在人類標本中，BE組織高表達BMP4，p-Smad1/5/8 and KLF4。我們用免疫組化SP法，染色證實了在人類BE標本中，BMP4在正常食管組織當中，陽性率9.1％，陽性染色主要集中在細胞質(zhì);p-Smad1/5/8陽性率56.8％，陽性染色也主要集中在細胞核;KLF4陽性率61.4％，陽性染色也主要集中在細胞核。BE組織中，BMP4陽性率94％，陽性

9、染色主要集中在細胞質(zhì);p-Smad1/5/8陽性率96％，陽性染色也主要集中在細胞核;KLF4陽性率96％，陽性染色也主要集中在細胞核。BE組織中BMP4和p-Smad1/5/8的陽性表達率均顯著高于正常食管組織，且差異具有顯著性(＜0.05)。
　　2.在大鼠標本中，BE組織高表達BMP4，p-Smad1/5/8 and KLF4。我們用免疫組化SP法，染色證實了大鼠BE組織中，正常食管組織BMP4陰性表達;p-Smad1/5/

10、8陰性表達。BE組織中，BMP4陽性表達，陽性染色主要集中在細胞質(zhì);p-Smad1/5/8陽性表達，陽性染色主要集中在細胞核;KLF4陽性表達，陽性染色主要集中在細胞核。BE組織中BMP4、 p-Smad1/5/8和KLF4的陽性表達率均顯著高于正常食管組織。
　　3.此外，在體外培養(yǎng)的細胞中，DCA上調(diào)了BMP4，KLF4，p-Smad1/5/8，CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達。我們還發(fā)現(xiàn)BMP4能夠上調(diào)KLF4

11、，p-Smad1/5/8，CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達，而Noggin則下調(diào)KLF4，p-Smad1/5/8，CDX2，MUC2 andMUC5ac的表達。另外，經(jīng)過siRNA-KLF4干擾的細胞，CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達下調(diào)，此時BMP4不能夠再度刺激CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達上調(diào)。同樣，經(jīng)過慢病毒過表達KLF4的細胞，CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達上調(diào)，此時

12、Noggin不能夠再度引起CDX2，MUC2 and MUC5ac的表達下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.DCA促進食管上皮細胞BMP4、p-Smad1/5/8、KLF4以及CDX2，MUC2和MUC5ac的表達。
　　2.外源性BMP4能激活BMP4信號通路，能夠上調(diào)p-Smad1/5/8、KLF4以及CDX2，MUC2和MUC5ac的表達。
　　3.KLF4的變化能夠影響CDX2，MUC2和MUC5ac的表達。