自噬參與胰高血糖素樣肽-2調(diào)節(jié)短腸綜合征腸適應的作用研究.pdf

1、腸系膜血管病變?nèi)菀滓鹦∧c缺血或壞死，繼而一次或多次手術(shù)最終導致短腸綜合征(short bowel syndrome，SBS)的發(fā)生。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusioninjury，IRI)是腸道缺血后再灌注反而加重損傷的過程，參與到腸系膜血管病導致SBS的發(fā)病機制中。自噬(autophagy)是普通存在于原核和真核生物的以細胞自我吞噬為主要機制的一種保守現(xiàn)象。在饑餓或者外界壓力的刺激下，細胞自噬可以被誘發(fā)，因此I

2、RI在一定條件下同樣可以誘發(fā)自噬的發(fā)生。本課題研究的主要目的即是通過在動物體內(nèi)模仿由于腸系膜血管病變導致SBS的臨床過程，進而研究腸切除術(shù)后不同時間點自噬和凋亡的表達以及胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like peptide-2，GLP-2）治療腸切除術(shù)后腸適應(intestinal adaption)過程的分子機制和通過自噬和凋亡表達變化探討腸切除術(shù)后早期開始給予GLP-2治療的最佳時間。
　　第一部分 腸切除術(shù)后剩余腸

3、管自噬和凋亡的表達
　　研究目的：
　　本部分實驗主要研究與假手術(shù)相比，腸切除術(shù)后不同時間點自噬和凋亡的表達情況。
　　研究方法：
　　(1)通過動物實驗分組分別建立假手術(shù)，單純MBR以及IRI合并MBR的動物模型;
　　(2)聯(lián)合電子顯微鏡(electron microscopy，EM)，聚合酶鏈反應(polymerasechain reaction，PCR)和Western Blotting等多種實驗方

4、法以及多種自噬標志物包括LC3，P62，Atg5和Beclin-1以檢測自噬在腸切除術(shù)后不同時間點的表達;
　　(3)通過Western印跡法檢測腸切除術(shù)后不同時間點凋亡相關(guān)蛋白二磷酸腺苷核糖多聚酶（Poly Adenosine Diphosphate Ribose Polymerase，PARP）和Caspase8的表達。
　　研究結(jié)果：
　　(1)電鏡結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時內(nèi)，腸切除術(shù)后腸組織中觀察到的自噬體的

5、數(shù)量顯著增加，腸切除術(shù)后72小時自噬體的數(shù)量明顯減少;
　　(2)與假手術(shù)相比，在mRNA水平上自噬標志物LC3，Atg5以及Beclin-1的表達在腸切除術(shù)后24小時內(nèi)均顯著增高，72小時上述標志物的表達則明顯減少。與此同時P62的表達在腸切除術(shù)后24小時內(nèi)顯著減少，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.01);
　　(3)在蛋白水平上，結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時內(nèi)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化率以及LC3Ⅱ的表達最為顯著，同時Atg5

6、和beclin-1的表達亦明顯增加，72小時上述標志物的蛋白表達則明顯減少。P62的表達在腸切除術(shù)后24小時內(nèi)顯著降低，而72小時則明顯增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(4)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase8在腸切除術(shù)后24小時無明顯變化，而在72小時和7天則顯著增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　與假手術(shù)相比，腸切除術(shù)后8小時，16小時和24小時，自噬無論在mR

7、NA還是在蛋白水平上的表達均有明顯增高，IRI合并MBR后自噬標志物的表達增高更為顯著。與此同時凋亡相關(guān)蛋白的表達在腸切除術(shù)后24小時并未有明顯增高。腸切除術(shù)后72小時自噬的表達較前有所降低，而凋亡相關(guān)蛋白的表達則顯著增高，腸切除術(shù)后7天凋亡的表達趨于穩(wěn)定。由此可以得出腸切除術(shù)后24小時內(nèi)自噬過度表達，可能啟動類似于凋亡的自噬性細胞死亡，同時可以拮抗凋亡的作用。腸切除術(shù)后72小時自噬的表達逐漸降低進而主要發(fā)揮對腸道組織保護性的機制，與此

8、同時凋亡的表達則逐漸增加，從而刺激腸道粘膜的自我更新，促進腸切除術(shù)后腸適應的進程。
　　第二部分 自噬參與胰高血糖素樣肽-2治療腸切除術(shù)后腸適應過程的分子機制
　　研究目的：
　　本部分實驗主要驗證與給予生理鹽水治療相比，腸切除術(shù)后不同時間點給予GLP-2治療后，可能通過Akt-mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬的表達進而參與到腸切除術(shù)后腸適應過程中。同時還驗證GLP-2治療后對腸切除術(shù)后腸道粘膜損傷的保護作用。
　　研究

9、方法：
　　(1)在第一部分動物模型的基礎(chǔ)上，腸切除術(shù)后不同時間點分別開始連續(xù)3天分別給予腹腔注射同等劑量的GLP-2和生理鹽水;
　　(2)免疫組化（immnohistochemistry，IHC）檢測腸切除術(shù)后不同時間點給予GLP-2治療后GLP-2受體的表達情況;
　　(3)Western Blotting檢測腸切除術(shù)后不同時間點治療后Akt-mTOR信號通路中Akt，mTOR和4EBP1分子的表達情況;

10、　　(4)酶聯(lián)免疫吸附反應（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蘇木精-伊紅染色(hematoxylineosin staining，HE)分別檢測腸切除術(shù)后不同時間點給予GLP-2治療后腸道中炎癥因子乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的表達和腸道粘膜損傷的評估。
　　研究結(jié)果：
　　(1)IHC結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時給予GLP-2治療后GLP-2

11、R表達顯著增加，72小時治療后則表達明顯減少，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(2)Western結(jié)果顯示與對照組相比，腸切除術(shù)后16小時給予GLP-2治療后信號通路相關(guān)分子Akt，mTOR及4EBP-1的表達開始顯著增加，24小時治療后相關(guān)分子表達達到峰值，而72小時治療后表達則有所降低，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(3)ELISA結(jié)果顯示腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后LDH的表達均有所降低

12、，但是無明顯統(tǒng)計學差異(p=0.282);
　　(4)病理切片染色結(jié)果顯示腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后腸道粘膜損傷評分明顯降低，尤以24小時治療時效果最為顯著，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　總的來說，與對照組相比，腸切除術(shù)后24小時給予GLP-2治療后可通過與高表達的GLP-2R結(jié)合后激活Akt-mTOR信號通路，進而調(diào)控自噬的表達參與到腸切除術(shù)后腸適應的過程中。但是推測在治療后的腸適

13、應的過程中可能還有PI3K-beclin-1等其它自噬相關(guān)信號通路的參與。與此同時，腸切除術(shù)后給予GLP-2治療后腸道粘膜的炎癥反應無明顯差異但對腸道粘膜損傷有顯著保護作用。
　　第三部分 通過自噬和凋亡的表達變化探討腸切除術(shù)后早期給予GLP-2治療的最佳時間
　　研究目的：
　　本部分實驗主要與生理鹽水治療相比，通過腸切除術(shù)后不同時間點給予GLP-2治療后自噬和凋亡的表達情況來進一步探討腸切除術(shù)后早期給予GLP-2腸

14、康復治療的最佳時間。
　　研究方法：
　　(1)動物模型同第二部分;
　　(2)除了第一部分自噬和凋亡的檢測方法以外還使用IHC和末端標記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)分別檢測自噬和凋亡的表達情況。
　　研究結(jié)果：
　　(1)電鏡結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時內(nèi)給予GLP-2治療后自噬體數(shù)量減少

15、最為顯著，72小時治療后自噬體數(shù)量有所增加;
　　(2)在mRNA水平上，腸切除術(shù)后24小時內(nèi)給予GLP-2治療后自噬標志物LC3，Atg5，beclin-1表達顯著降低，尤其以24小時治療后最為明顯，與此同時P62的表達在治療后明顯增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(3)Western的結(jié)果表明腸切除術(shù)后24小時給予GLP-2治療后LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化率及LC3Ⅱ的表達明顯降低，同時Atg5，Becl

16、in-1的表達也在治療后被明顯抑制，而P62的表達則在治療后顯著增加。72小時治療后自噬相關(guān)蛋白的表達顯著增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(4)凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase8在腸切除術(shù)后24小時內(nèi)給予GLP-2治療后無明顯變化，腸切除術(shù)后72小時治療后凋亡的表達明顯受抑制，7天治療后凋亡的表達有所增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001);
　　(5)IHC的結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時治療后LC

17、3，Atg5以及Beclin-1表達明顯減少，而P62表達明顯增加，72小時治療后LC3，Atg5以及Beclin-1表達明顯增加，而P62表達明顯減少，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.01);
　　(6)TUNEL的結(jié)果顯示腸切除術(shù)后24小時治療后凋亡小體的數(shù)量無明顯變化，而72小時治療后凋亡小體的數(shù)量明顯減少，7天治療后其數(shù)量顯著增加，各組間均有統(tǒng)計學差異(p＜0.001)。
　　研究結(jié)論：
　　腸切除術(shù)后8小時和1