柱狀黃桿菌嗜熱菌蛋白酶基因的鑒定.pdf

1、用兔抗F. columnare外膜蛋白多抗從其表達(dá)文庫(kù)中篩選出嗜熱菌蛋白酶(TLN)基因，其開放閱讀框包含2709nt，編碼902aa。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)TLN含有兩個(gè)鋅金屬蛋白酶保守基序HExxH和(GxxNExxSD說(shuō)明其屬于嗜熱菌蛋白酶家族。將TLN催化域和α螺旋域克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳顯示重組融合蛋白TLN-C在分子量約58kD處有

2、明顯表達(dá)帶，主要以不可溶的包涵體形式存在。變性條件下利用His·Bind樹脂純化融合蛋白，用其免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗重組TLN-C多克隆抗體。用抗六個(gè)組氨酸的單抗或是兔抗重組蛋白多抗血清為第一抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，重組蛋白(58kD)均能與其發(fā)生較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明制備的多抗血清有效。用兔抗重組蛋白多抗血清為第一抗體對(duì)柱狀黃桿菌胞外蛋白和外膜蛋白進(jìn)行印跡實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，胞外蛋白在約42kD蛋白條帶處有陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)