轉基因水稻中標記基因水平轉移評價的系統(tǒng)生物學方法研究.pdf

1、標記基因目前廣泛用于植物的遺傳轉化，隨著轉基因植物商品化種植，轉基因植物食品中標記基因能否水平轉移至消化道微生物或上皮組織并成功結合和表達，成為需要回答的潛在食品安全問題之一。因此，開展轉基因植物食品中標記基因水平轉移研究成為轉基因食品安全性評價的一個重要方面。
　　 潮霉素B磷酸轉移酶(hygromycin B phosphotransferase)基因(hpt)是一種常用的抗生素選擇標記基因，它來自Streptomyces

2、Hygroscopicus的aph(4)-Ta基因編碼的氨基糖苷4-磷酸轉移酶。在植物轉化中，潮霉素抗性基因(hpt)的選擇效率在某些作物(如禾谷類)上較其他標記基因高。我國科學家研制出具有自主知識產(chǎn)權和產(chǎn)業(yè)化前景的轉sck水稻s86，所使用的標記基因即為hpt。本研究以轉sck或sck+Bt基因水稻s86品系含hpt和去標記產(chǎn)品為范例，利用基因穩(wěn)定性、缺失修復和蛋白質組表達差異，對標記基因安全性評價方法進行研究。
　　 ⑴利用

3、自行設計的定性PCR和實時定量PCR擴增體系，對hpt在不同加工條件和體外模擬消化條件下的穩(wěn)定性進行了研究，以確定其發(fā)生水平轉移的可能性是否存在。結果表明，加工米飯、粥大于500bp的片段已降解，爆米花和鍋巴大于236bp的hpt片段已降解。對照M86大米加工米飯和粥僅能擴出植物葉綠體基因rbc1片段，爆米花、鍋巴及空白對照所有擴增均為陰性。利用定性PCR體系和實時定量PCR體系對體外模擬消化道樣品進行擴增，結果顯示經(jīng)過加工和/或胃腸道

4、的作用以后，hpt基因已降解成較小片段，從量上來講絕大部分也已降解。表明hpt在轉基因大米加工食品中均已不同程度的發(fā)生了降解，不同加工方式對hpt片段降解影響顯著，經(jīng)過加工和/或胃腸道的作用以后，hpt基因已降解成較小片段，從量上來講絕大部分也已降解，以較大或完整片段向食品或消化道微生物轉移的可能性減小。
　　 ⑵自行構建了基于同源重組的標記修復系統(tǒng)開展DNA的轉化能力研究。以含hpt缺失片段的受體菌E.coli JM109(重

5、組酶基因缺失的工程菌)和E.coli MG1655(野生型)為受體菌構建標記修復系統(tǒng)；以含完整hpt片段的PCR產(chǎn)物、轉sck基因水稻基因組DNA和供體質粒對受體菌進行轉化實驗，在實驗室條件下沒有觀察到標記修復的發(fā)生。用枯草桿菌構建的標記修復系統(tǒng)正在構建中。
　　 ⑶建立了水稻2種組織樣品(大米和葉苗)和加工米飯蛋白樣品制備方法，以轉sck基因水稻、轉sck+Bt基因水稻、轉sck+Bt基因水稻(刪除hpt基因)及親本ck水稻為

6、研究對象，應用PCR技術及雙向凝膠電泳(2DE)與基質輔助激光誘導解離-串聯(lián)時間飛行質譜(MALDI-TOF-TOF)技術，對水稻葉苗、大米和米飯的蛋白質組開展了初步研究。經(jīng)過2DE后銀染膠的比對，在水稻葉苗、大米、米飯樣品分別與親本對應樣品間不僅均有蛋白點表現(xiàn)為量和質的變化，而且在各組內(nèi)蛋白點的變化與親本相比具有差異點顯現(xiàn)比較一致的特點，提示其可能與轉基因的操作有關。對轉sck+Bt大米(未去標記)和親本M86大米進行全蛋白質組學測定

7、，結合銀染膠比對結果，發(fā)現(xiàn)轉基因水稻中本身具有的4個蛋白OSJNBa0038O10.14(α-淀粉酶)、putative triosephosphate isomerase(假定的磷酸丙糖異構酶)和glutelin(谷蛋白)表達上調或下調；去標記轉sck+Bt大米與親本比較顯現(xiàn)出更多差異，可能與標記基因的剔除操作有關，其中的4個差異點有待進一步研究。PCR擴增結果表明轉基因水稻種子中存在外源基因hpt和sckt和Bt，但轉sck+Bt基

8、因水稻的全蛋白質組質譜鑒定結果并未檢測到這三個基因表達產(chǎn)物，其原因可能是由于水稻種子處于休眠狀態(tài)，基因轉錄水平低，從而導致蛋白表達水平低。這也間接表明所評價轉基因水稻蛋白表達的選擇性，稻谷更加安全。
　　 在轉基因操作過程中，多個拷貝的外源基因或者基因片段經(jīng)常隨機插入作物原有基因中，有可能造成原有基因的缺失或重排，產(chǎn)生非期望效應。這些效應包括干擾或破壞原有基因功能，甚至發(fā)生基因沉默，形成新的代謝物或者改變已有代謝物水平，進而有可