TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌病程中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分 TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達水平
　　目的：探討子宮內(nèi)膜癌中TESTIN基因的表達水平，為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷提供依據(jù)。
　　方法：收集68例子宮內(nèi)膜癌患者的子宮內(nèi)膜癌組織68例及相應的癌旁組織68例，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌60例，子宮漿液性乳頭狀腺癌8例。免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜癌組織及其癌旁正常組織中TESTIN基因的蛋白表達水平并對TESTIN基因表達與臨床參數(shù)之間的關系進行統(tǒng)計學分析。采用甲基化特異性PC

2、R檢測子宮內(nèi)膜癌組織、細胞中TESTIN基因啟動子的甲基化狀態(tài)，分析其與TESTIN表達水平之間的相關性。
　　結(jié)果：子宮內(nèi)膜癌的癌旁正常組織中 TESTIN蛋白呈陽性表達，而絕大部分(52／68)的子宮內(nèi)膜癌組織中TESTIN蛋白表達顯著下降（p<0.O1)。進一步分析顯示：子宮內(nèi)膜樣腺癌組中TESTIN蛋白表達水平下降率較漿液性乳頭狀腺癌組明顯升高(χ2=13.34，p=0.001)。根據(jù)MSP的結(jié)果，44.1％(30/68)

3、的子宮內(nèi)膜癌中 TESNTIN啟動子為高甲基化狀態(tài)，而在正常內(nèi)膜組織中僅為3.6%(1/28)，p<0.001)。統(tǒng)計學分析顯示TESNTIN啟動子高甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.03)顯著相關。同時，TESTIN表達水平下降與其高甲基化狀態(tài)相關(p=0.021)。甲基化處理可恢復AN3CA細胞內(nèi)TESTIN表達。
　　結(jié)論：TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中表達顯著下降，啟動子區(qū)域的高甲基化是TESTIN基因在子宮內(nèi)膜癌中表達缺失的主

4、要原因。
　　第二部分 TESTIN在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制
　　目的：探討TESTIN甲基化在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其分子機制。
　　方法：分別構(gòu)建TESTIN過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-TESTIN和干擾質(zhì)粒shRNA-TESTIN；將上述兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細胞并構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞株，應用實時PCR方法和western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后TESTIN基因的表達。應用MTT法、克隆形成實驗、Transwell

5、實驗、實時PCR和western blot等方法檢測TESTIN對子宮內(nèi)膜癌細胞的生長、克隆形成和侵襲能力的影響，光學顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜癌細胞的形態(tài)學變化，實時PCR和western blot方法檢測與EMT相關的E-鈣粘連蛋白、Snail，波蛋白和N-鈣粘連蛋白的mRNA和蛋白表達水平的變化。分別使用TESTIN穩(wěn)定過表達和干擾的子宮內(nèi)膜癌細胞株建立建立子宮內(nèi)膜癌裸鼠模型，觀察 TESTIN對腫瘤生長的抑制作用，驗證TESTIN對E

6、MT過程的調(diào)控。
　　結(jié)果：在AN3CA細胞中，TESTIN過表達可明顯抑制細胞的生長、克隆形成和侵襲能力；同時，TESTIN過表達后誘導AN3CA細胞出現(xiàn)上皮性轉(zhuǎn)變，上皮性標志物E-cadherin的表達水平明顯上升，而間質(zhì)性標志物 Snail，N-cadherin，vimentin的表達則被顯著抑制；相反地，在TESTIN敲低的Ishikawa細胞中，細胞的生長、克隆形成和侵襲能力得到增強；同時，干擾TESTIN基因后 Ish