肝癌微球體細胞特異性結合七肽的篩選.pdf

1、目的：篩選能夠與高轉移性HCCLM3肝癌微球體特異性結合的環(huán)七肽，為后續(xù)的生物醫(yī)學應用提供靶向分子。
　　方法：利用超低吸附培養(yǎng)瓶和無血清培養(yǎng)基對HCCLM3進行培養(yǎng)，誘導其形成肝癌微球體。以肝癌微球體為靶細胞，HCCLM3和 LO2為吸附細胞，應用噬菌體環(huán)七肽庫進行全細胞差減篩選。四輪篩選后，隨機挑選噬菌體單克隆進行測序；根據測序結果，采用cell-ELISA對不同類型噬菌體克隆與肝癌微球體結合的親和力和特異性進行檢測。根據特異

2、性最高的噬菌體克隆的融合蛋白基序來合成對應的環(huán)七肽。使用競爭抑制試驗檢驗合成多肽對噬菌體克隆與靶細胞結合的抑制作用。運用激光共聚焦顯微鏡進一步驗證合成多肽與肝癌微球體結合的特異性。細胞毒性試驗檢測多肽的生物學活性。
　　結果：通過懸浮培養(yǎng)，LM3細胞成功聚集成球形成微球體，四輪差減篩選后，噬菌體克隆在肝癌微球體的富集率從（8.50×10-5±1.70×10-5）%提高到（1.0×10-2±4.08×10-4）%(P<0.001)。

3、cell-ELISA結果顯示P26號噬菌體克隆與肝癌微球體結合的特異性最高，其展示多肽的氨基酸序列為 NTGSPYE(命名為NTG肽)。競爭抑制試驗結果表明：NTG肽對P26噬菌體與肝癌微球體的結合有抑制作用（P<0.01或P<0.001）。運用激光共聚焦顯微鏡觀察標記FITC的NTG肽與細胞結合的結果顯示：NTG肽能與肝癌微球體特異性結合，而與無關細胞則不發(fā)生結合。細胞增殖試驗顯示：NTG肽對細胞生長沒有增殖活性。
　　結論：用