黃粉甲抗凍蛋白的原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè).pdf

1、昆蟲(chóng)抗凍蛋白具有較高的抗凍活性，生物體內(nèi)微量的抗凍蛋白很難滿足諸多方面應(yīng)用。因此，探索出生產(chǎn)抗凍蛋白的有效方法亟待解決。本研究基于此目的利用基因工程的技術(shù)和方法開(kāi)展了抗凍蛋白基因的分子克隆和表達(dá)工作。以黃粉甲為材料，提取4℃冷處理4周的黃粉甲脂肪體總RNA；運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增和克隆出了afp72，afp84a，afp84b，afp84c，afp84d，afp84e六個(gè)黃粉甲抗凍蛋白基因，并在Genbank中注冊(cè)。其中基因afp72

2、經(jīng)核酸和蛋白水平分析確定為新的黃粉甲抗凍蛋白基因，目的基因afp72，afp84a與其它抗凍蛋白基因具有高度同源性(分別達(dá)到79.48％和98.81％)，分別編碼72和84個(gè)氨基酸的成熟蛋白，AFP72缺少由12氨基酸組成的的重復(fù)單元，保守單元TXT在不同序列中具有高度保守性。將基因afp72，afp84a與載體pMAL-c2X和pMAL-p2X雙酶切后連接，構(gòu)建兩個(gè)融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-afp72，pMAL-c2X-afp84

3、a和兩個(gè)分泌融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-p2X-72，pMAL-p2X-84a；表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliTBI后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表現(xiàn)為可溶性；通過(guò)優(yōu)化組合，最適的發(fā)酵條件是：誘導(dǎo)溫度為25℃，初始誘導(dǎo)菌濃度A600為0.6左右，誘導(dǎo)時(shí)間為8小時(shí)，IPTG濃度為0.5mmol/L。超聲波細(xì)胞破碎法使融合蛋白AFP72從含有融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-afp72的細(xì)胞中釋放。對(duì)于分泌融合表達(dá)質(zhì)粒pMAL-p2X-afp84a，Mg