NLRP3炎癥小體在帕金森病神經(jīng)炎癥中的作用及治療學(xué)意義研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 Caspase-1在RAW264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及其機(jī)制
　　目的:
　　研究caspase-1及NLRP3炎癥小體在RAW264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　應(yīng)用LPS+ATP誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞建立外周炎癥損傷細(xì)胞模型，并用激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液進(jìn)一步誘導(dǎo)BV2小

2、膠質(zhì)細(xì)胞建立中樞神經(jīng)炎癥細(xì)胞模型，研究caspase-1抑制劑(z-YVAD)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)作用及其機(jī)制。ELISA法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞及BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中相關(guān)炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)水平;Western blotting分析檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平;應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察p65核轉(zhuǎn)位情況。
　　結(jié)果:
　　1、LPS+ATP刺激RAW264

3、.7巨噬細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)其上清液中相關(guān)炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)上調(diào);Western blotting分析發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體表達(dá)明顯升高。Caspase-1抑制劑可有效抑制上述炎癥因子及相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明caspase-1抑制劑可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。（*p＜0.05，**p＜0.01 and***p＜0.001）
　　2、由激活的RA

4、W264.7巨噬細(xì)胞上清液誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化，ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其上清液中相關(guān)炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)上調(diào);Western blotting分析發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白及NLRP3炎癥小體表達(dá)也明顯升高;共聚焦顯微鏡觀察到p65入核。Caspase-1抑制劑通過(guò)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞的抑制作用，可進(jìn)一步顯著抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子及相關(guān)蛋白的表達(dá)。表明經(jīng)z-YVAD預(yù)處理后，

5、LPS+ATP誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用明顯減輕。(*p＜0.05，**p＜0.01 and***p＜0.001)
　　結(jié)論:
　　1、抑制caspase-1能夠減輕LPS+ATP誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用。
　　2、Caspase-1抑制劑通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)水平，可以有效減少LPS所致的炎癥反應(yīng)?！狽LRP3炎癥小體可能參與

6、PD神經(jīng)炎癥損傷機(jī)制，并有可能成為保護(hù)DA能神經(jīng)元、治療PD的重要靶點(diǎn)，本研究為PD的病因治療學(xué)提供新策略和新方向。
　　第二部分 GM1對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制
　　目的:
　　觀察GM1對(duì)PD神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及其與NF-κB通路和NLRP3-caspase-1炎癥小體的相關(guān)性。
　　方法:
　　5周齡C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、MPTP組及MPTP+GM1組。

7、實(shí)驗(yàn)第1-3天:MPTP+GM1給予25mg/kg GM1腹腔注射，每天一次，連續(xù)3天，對(duì)照組及MPTP組給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第4-8天:MPTP組及MPTP+GM1組皮下注射25mg/kg MPTP，每天一次，連續(xù)5天;MPTP+GM1組25mg/kg GM1腹腔注射，每天一次，連續(xù)5天，對(duì)照組給予等量生理鹽水。分別評(píng)估各組PD小鼠模型行為學(xué)變化。免疫組織化學(xué)染色觀察中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化數(shù)量;Wes

8、tern blotting法檢測(cè)上述腦區(qū)NF-κB信號(hào)通路的激活情況（胞核p65、胞漿p65、P-IKKβ）及NLRP3炎癥小體(NLRP3、caspase-1)的表達(dá)情況。ELISA法檢測(cè)PD小鼠模型外周血清中及中腦SNc區(qū)腦組織中的相關(guān)炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、相較于MPTP組，GM1+MPTP組PD小鼠模型行為學(xué)功能明顯改善。表明GM1能夠抑制MPTP誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)

9、元損傷作用，改善PD動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)功能。（*p＜0.05，**p＜0.01）
　　2、與MPTP組相比，GM1+MPTP組PD小鼠模型中腦黑質(zhì)TH細(xì)胞死亡數(shù)量減少，小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量亦明顯減少。表明GM1能夠減少PD動(dòng)物模型中腦黑質(zhì)TH細(xì)胞的死亡以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。（**p＜0.01）
　　3、MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中腦SNc腦組織中存在NF-κB通路的激活，胞核p65、P-IKKβ相

10、關(guān)蛋白均表達(dá)增加;GM1能夠有效抑制上述NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。另外，Western blotting分析發(fā)現(xiàn)GM1能有效減少中腦SNc腦組織中NLRP3炎癥小體(NLRP3、caspase-1)表達(dá)水平。（*p＜0.05，**p＜0.01）
　　4、MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型外周血清中及中腦SNc區(qū)腦組織中相關(guān)炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表達(dá)上調(diào)。GM1能夠有效抑制上述炎癥因子的表達(dá)。（*p＜0.0

11、5，**p＜0.01）
　　結(jié)論:
　　1、GM1能夠改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的行為學(xué)及病理學(xué)損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2、GM1神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制涉及抑制NLRP3-caspase-1炎癥小體，減少神經(jīng)炎癥導(dǎo)致的DA能神經(jīng)元變性壞死。
　　綜上所述，本文的主要?jiǎng)?chuàng)新之處在于:
　　1、NLRP3-Caspase-1炎癥小體與PD等神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)炎癥病理機(jī)制密切相關(guān)
　　本文通過(guò)離體研究

12、發(fā)現(xiàn)抑制caspase-1可以減輕激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用，提示caspase-1和NLRP3炎癥小體參與巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，表明caspase-1和NLRP3炎癥小體參與PD等神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)炎癥及全身炎癥病理?yè)p傷機(jī)制，進(jìn)一步揭示caspase-1和NLRP3炎癥小體可作為PD等神經(jīng)退行性疾病的全身炎癥多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)制。
　　2、GM1對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制涉

13、及抑制NLRP3炎癥小體
　　本文通過(guò)在體研究發(fā)現(xiàn)GM1能夠改善MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型運(yùn)動(dòng)功能障礙，減少中腦SNc區(qū)DA能神經(jīng)元的死亡數(shù)量以及中腦SNc區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量，抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白和NLRP3-caspase-1炎癥小體的表達(dá)水平上調(diào)以及減輕外周血清中及中腦SNc區(qū)腦組織中相關(guān)炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達(dá)情況。研究表明MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中腦SNc區(qū)存在炎癥反應(yīng)并導(dǎo)