人乳頭瘤病毒致宮頸癌的型別特異性差異的研究.pdf

1、在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第二大常見的惡性腫瘤，每年有527，624個新發(fā)病例和265，653個死亡病例(www.hpvcentre.net in Oct31th，2014)，其中85％的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家。宮頸癌病因明確，大量的研究表明高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及癌前病變的主要致病因素。HPV分高危型和低危型，高危型包括:HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV5

2、2、HPV56、HPV58、HPV61等。研究表明，HR-HPV表達的病毒癌基因E6和E7，可分別結合降解宿主細胞P53和Rb，引起細胞周期、增殖、侵襲、轉移等生物學行為改變，促進細胞的惡性轉化，最終導致宮頸癌發(fā)生與進展。但對不同型別的病毒癌蛋白之間是否存在差異尚不清楚。流行病學證據(jù)顯示，各種型別HPV在細胞學正常婦女和不同宮頸病變患者中的感染頻率并不相同，反應了不同型別病毒感染力和致病力的不同，但是否與宿主對HPV型別特異的易感性有關

3、所知甚少。
　　本研究從不同型別HPV致宮頸癌能力差異和不同型別HPV感染宿主是否與宿主易感性有關兩方面進行研究，首先通過設計兩條HPV58 E6特異性多肽片斷，將多肽交聯(lián)至三種不同載體蛋白，免疫兔子，獲得特異性HPV58 E6兔單克隆抗體。其次，通過構建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16 E6/E7真核生物表達質(zhì)粒，轉染293T和U2OS細胞，觀察HPV58E6/E7和HPV16

4、E6/E7基因對細胞的周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達差異，比較兩者致癌能力的差異。最后，收集3299例宮頸脫落細胞樣本，選出875例單純HPV16，18，52，58陽性和HPV陰性，提取DNA，通過Illumina BeadXpress VeraCode platformSNP分型檢測技術，對HPV感染相關受體基因(EGFR，PPIB，HSPG2，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)URIN，ITGA6，TSPAN1和SDC2)上的96個tagS

5、NP位點進行檢測，分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和宮頸病變進展的相關性。
　　本研究首次成功獲得了HPV58E6單克隆抗體;在體外實驗中驗證了相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7具有更強的促細胞周期進程、抑制細胞凋亡、促進細胞侵襲的能力，進一步揭示了E6-P53和E7-pRB在HPV致癌過程中所起的關鍵作用;還發(fā)現(xiàn)了與HPV型別特異性感染及其致宮頸病變進展相關的差異宿主SNP位點，基因型及單倍型。本研究初步闡述了

6、HPV在自然界的分布規(guī)律和不同病變中分布特征的相關機制，更好地了解了HPV的致癌中的型別特異性差異，為制定有針對性的宮頸癌防控策略提供了科學證據(jù)。
　　第一部分 HPV58E6兔單克隆抗體的制備
　　目的:
　　研發(fā)HPV58E6特異性兔單克隆抗體，為進一步體外研究HPV58E6提供基礎。
　　方法:
　　通過將HPV58E6序列與HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E

7、6等同源性較高的序列進行比對，找出HPV58E6的特異性序列，針對該特異性序列設計兩條HPV58E6多肽片斷，將其交聯(lián)至三種不同載體蛋白，免疫新西蘭大白兔，獲得免疫血清，取血清篩選出抗體陽性的大白兔并做ELISA確定滴度，分離篩選出的大白兔脾細胞并與融合伴侶細胞240E-W2進行細胞融合，之后鋪板到96孔培養(yǎng)板，在1640AB培養(yǎng)基中進行克隆培養(yǎng)，對細胞上清進行ELISA篩選，找到表達HPV58E6特異性抗體的陽性細胞克隆，針對陽性克隆

8、，提取細胞RNA，用引物F1/R1進行RT-PCR擴增，得到多個重鏈cDNA和多個輕鏈cDNA;將cDNA分別構建到pTT5質(zhì)粒表達載體中，將包含重鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒與包含輕鏈cDNA的pTT5質(zhì)粒進行兩兩配對，共轉染到HEK-293-6E細胞后進行細胞培養(yǎng);取細胞培養(yǎng)的上清液，進行ELISA檢測;篩選IgG濃度最高且滴度OD值大于0.3的配對，即為HPV58E6特異性兔單克隆抗體的重鏈和輕鏈配對。制備重組抗體并進行測序分析，從而

9、獲得特異性HPV58E6兔單克隆抗體。
　　結果:
　　1.設計的特異性HPV58E6多肽片段免疫新西蘭大白兔后獲得的血清能夠結合pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉染293T細胞所提取的蛋白。
　　2.雜交瘤細胞上清在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉染組未見條帶，而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉染組可見條帶。
　　3.重組抗體ZJM1B-9在pEGFP-C1-HPV16E6質(zhì)粒轉染組未見條帶，

10、而在pEGFP-C1-HPV58E6質(zhì)粒轉染組可見條帶。
　　結論:
　　1.采用雜交瘤技術可以成功獲得抗HPV58E6兔單克隆抗體。
　　2.獲得的抗HPV58E6兔單克隆抗體可以特異性結合HPV58E6蛋白，而不能結合HPV16E6蛋白。
　　第二部分:HPV58與HPV16 E6/E7致宮頸癌功能差異的研究
　　目的:
　　明確HPV16與HPV58癌基因E6/E7在細胞表型方面的差異，及E6-

11、P53和E7-pRB的表達和定位的區(qū)別，從細胞表型和分子水平闡述兩種病毒致癌能力的差異。
　　方法:
　　通過構建pFLAG-CMV5.1-HPV58E6/E7和pFLAG-CMV5.1-HPV16E6/E7真核生物表達質(zhì)粒，轉染293T和U2OS細胞，通過流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，CCK8檢測細胞增殖能力，Transwell檢測細胞侵襲能力，免疫熒光共聚焦拍攝細胞E6-P53和E7-pRB的共表達和共定位，比較HPV5

12、8E6/E7和HPV16E6/E7基因對細胞周期、凋亡、侵襲能力的差異及下游分子的表達差異。
　　結果:
　　1.在293T和U2OS細胞中，相比陰性對照組，HPV58E6/E7過表達能促進細胞增殖;相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7過表達促進細胞增殖能力更強。
　　2.在293T細胞中，HPV58E6/E7組細胞周期S期比例分別為42.68％和45.39％，而HPV16E6/E7組細胞周期S期比例分別52

13、.66％和49.18％。在U2OS細胞中，HPV58E6/E7組細胞周期S期比例分別為32.73％和27.03％，而HPV16E6/E7組細胞周期S期比例分別37.32％和36.24％。
　　3.在293T細胞中，HPV58E6/E7組細胞早期凋亡比例分別為9.66％和12.1％，而HPV16E6/E7組細胞早期凋亡比例分別為6.6％和14.0％。在U2OS細胞中，HPV58E6/E7組細胞早期凋亡比例分別為5.63％和5.22％

14、，而HPV16E6/E7組細胞早期凋亡比例分別為3.84和3.44％。
　　4.在293T和U2OS細胞中，相比陰性對照組，HPV58E6/E7組細胞侵襲能力增強;相比HPV58E6/E7，HPV16E6/E7組細胞侵襲能力更強。
　　5.在293T和U2OS細胞中，相比HPV58E6組，HPV16E6組P53下降更顯著，且胞核內(nèi)表達更低;同時相比HPV58E7組，HPV16E7組pRB表達增多，且在核內(nèi)表達更多。
　

15、　結論:
　　與HPV58 E6/E7相比，HPV16 E6/E7顯示了更強的促進細胞周期進程、抑制細胞凋亡、促進細胞侵襲能力和降解P53和pRB能力，提示HPV16比HPV58具有更強的致癌力。
　　第三部分:HPV相關受體基因變異與型別特異宮頸感染和病變進展的相關性研究
　　目的:
　　明確不同個體之間的HPV感染相關受體是否存在型別特異的與宮頸感染和病變進展的相關的單核甘酸多態(tài)性(single nucleo

16、tide polymorphisms，SNPs)。
　　方法:
　　在3299例宮頸脫落細胞樣本中，挑選出單一HPV16，18，52，58陽性和HPV陰性，共875例，提取DNA，通過Illumina BeadXpress VeraCode platform SNP分型檢測技術，對HPV感染相關受體基因（EGFR，PPIB，HSPG2，F(xiàn)GFR2，F(xiàn)URIN，ITGA6，TSPAN1和SDC2）上的96個tagSNP位點進行

17、檢測，分析目的基因SNP與型別特異HPV感染和宮頸病變進展的相關性。在對照組中檢驗Hardy-Weinberg平衡。運用Haploview，SPSS16.0，PLINK等軟件分析SNP結果。
　　結果:
　　對病毒型別特異性感染的易感性分析顯示，HPV16有2個SNP(rs28384376，rs12034979)顯著相關和3個單倍型（“GGAA”，“GGGG”和“GA”）臨界相關，HPV18有4個SNP(rs2575738，

18、rs6697265，rs2575712，rs2575735)和3個單倍型(“GGG”，“GGA”和“GGAGA”)顯著相關，HPV52有2個SNP(rs10510097，rs12718946)和2個單倍型（“GGGAA”和“GGA”）顯著相關，HPV58有3個SNP(rs4947972，rs2981451，rs2575735)和2個單倍型（“GC”和“GA”）顯著相關。
　　對病毒型別特異性宮頸病變進展的易感性分析顯示，HPV16

19、有5個SNP(rs3135772，rs2556537，rs12034979，rs1047057，rs16894821)和1個單倍型(“GG”)顯著相關，HPV18有3個SNP(rs6697265，rs6680566，rs16860426)和1個單倍型(“GG”)顯著相關，HPV52有3個SNP(rs878949，rs12718946，rs12668175)和1個單倍型(“CAA”)顯著相關，HPV58未見有顯著相關的SNP位點和單倍型。