新型載萬(wàn)古霉素類(lèi)骨磷灰石-聚氨基酸緩釋系統(tǒng)治療慢性骨髓炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：對(duì)已經(jīng)成功制備的新型載PLGA-萬(wàn)古霉素類(lèi)骨磷灰石/聚氨基酸緩釋支架分別就其毒副作用、組織相容性、藥物釋放特性、抗菌活性及成骨活性進(jìn)行體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，以期全面、系統(tǒng)評(píng)估該材料生物安全性及有效性，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。
　　方法：所有實(shí)驗(yàn)均包括體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分成四部分實(shí)施：
　　1、毒性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)載萬(wàn)古霉素復(fù)合人工骨組（VC組）、不載藥復(fù)合人工骨組（VUC組）、陰性對(duì)照組(NC組)及陽(yáng)性對(duì)照組（PC組）。體

2、外實(shí)驗(yàn)將成功制備的材料浸提液與L929細(xì)胞和抗凝兔血共培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、MTT法測(cè)細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率評(píng)估材料對(duì)人組織細(xì)胞毒性、分光光度法評(píng)估其溶血率。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)先建立新西蘭大白兔右側(cè)脛骨近端慢性骨髓炎動(dòng)物模型，按分組行清創(chuàng)并植入各材料，術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況、檢測(cè)肝腎功、血藥濃度及肝腎組織切片檢查，以評(píng)估在體內(nèi)該新型載萬(wàn)古霉素材料對(duì)動(dòng)物的毒性及組織相容性。
　　2、藥物釋放實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)VC組和PC組（載萬(wàn)古霉素PMMA材

3、料），體外實(shí)驗(yàn)先制作每間隔48小時(shí)的連續(xù)材料浸提液，采用高效液相色譜法測(cè)量浸提液中萬(wàn)古霉素濃度，繪制體外藥物釋放曲線、計(jì)算累計(jì)釋放百分比。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)先于新西蘭大白兔雙側(cè)股骨髁制作直徑5mm、深6mm的圓柱形缺損，按分組植入各材料，術(shù)后不同時(shí)間測(cè)量植入局部萬(wàn)古霉素濃度，并繪制體內(nèi)釋放曲線圖。
　　3、抗菌活性實(shí)驗(yàn)：先根據(jù)菌種分為標(biāo)準(zhǔn)金葡菌菌組和MRSA菌組，每個(gè)菌組里又隨機(jī)分為VUC小組、VC小組及PC小組（載萬(wàn)古霉素PMMA材料），

4、體外實(shí)驗(yàn)將各材料分別置于接種有兩種細(xì)菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)5天后，測(cè)量材料周?chē)志h(huán)大小，并將材料浸提液與各菌液共培養(yǎng)，根據(jù)共培養(yǎng)后菌夜?jié)岫扔?jì)算抑菌率，比較各組抗菌作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同前制作脛骨近端慢性骨髓炎動(dòng)物模型，先分成標(biāo)準(zhǔn)金葡菌組和MRSA組，每組又隨機(jī)分成四個(gè)小組：A小組：VC組；B小組：V-PMMA組；C小組：VUC組；D小組：BC組，按分組行清創(chuàng)植入各材料，術(shù)后觀察模型一般情況，行病灶X片評(píng)分，監(jiān)測(cè)血白細(xì)胞及病灶細(xì)菌濃度，并行大體及

5、組織學(xué)評(píng)估。
　　4、成骨活性實(shí)驗(yàn)：體外實(shí)驗(yàn)分為VUC組、VC組及空白組（BC），將各材料與成骨樣細(xì)胞MG63共培養(yǎng)，以倒置相差顯微鏡及電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及與材料粘附情況，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制其生長(zhǎng)曲線。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP及鈣含量評(píng)估成骨活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)先制作慢性骨髓炎的動(dòng)物模型，分成標(biāo)準(zhǔn)金葡菌組和MRSA組，每組又隨機(jī)分成四個(gè)小組：A小組：VC組；B小組：V-PMMA組；C小組：VUC組；D小組：BC組，按分組行清創(chuàng)植入各材

6、料，術(shù)后通過(guò)大體標(biāo)本、X片、組織切片染色、鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記評(píng)估體內(nèi)成骨情況。
　　結(jié)果：
　　5、毒性實(shí)驗(yàn)：在體外各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VC組及VUC組的毒性分級(jí)均為1級(jí)以下，鏡下細(xì)胞形態(tài)與 NC組無(wú)明顯差別，兩組兔血的溶血率分別為2.27％及1.42%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ISO規(guī)定（<5%）。在體內(nèi)與NC組比較，各監(jiān)測(cè)指標(biāo)無(wú)明顯差異，體內(nèi)各代謝時(shí)相點(diǎn)萬(wàn)古霉素血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其中毒水平(60mg/L)。
　　6、藥物釋放實(shí)驗(yàn)：VC組體外萬(wàn)古

7、霉素釋放表現(xiàn)出明顯三相釋放特點(diǎn)，前48小時(shí)表現(xiàn)出高濃度突釋?zhuān)?0天出現(xiàn)第二個(gè)釋放高峰，之后釋放逐漸下降。累積釋放量在第一個(gè)48小時(shí)為43.02%，38天時(shí)達(dá)到89.22%。在體內(nèi)兩種材料的萬(wàn)古霉素釋放曲線均表現(xiàn)為雙相，釋藥峰值均大約在第14天，之后累積濃度進(jìn)行性下降。VC組體內(nèi)釋放藥物濃度保持在MIC90以上近42天，而PC組不到28天。
　　7、抗菌活性實(shí)驗(yàn)：在體外無(wú)論是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金葡菌還是MRSA菌VC組和PC組均可見(jiàn)明顯抑菌環(huán)

8、形成，但VC組直徑較PC組大，抑菌時(shí)間持續(xù)超過(guò)28天。PC組抑菌作用僅持續(xù)14天。VUC組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)抑菌環(huán)形成，抑菌率低于20%。標(biāo)準(zhǔn)金葡菌與MRSA菌間無(wú)差別。體內(nèi)無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)菌組還是MRSA菌組的A、B小組，術(shù)后模型均無(wú)病理性骨折、體重恢復(fù)、無(wú)竇道形成，白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降。與術(shù)前比較，Norden評(píng)分明顯改善、肉眼觀及鏡下觀炎性反應(yīng)明顯好轉(zhuǎn)，與術(shù)前及另兩組比較，單位重量骨標(biāo)本菌落數(shù)明顯減少。
　　8、成骨活性實(shí)驗(yàn)：在體外將兩

9、種材料與 MG63細(xì)胞共培養(yǎng)后，與BC組比較，細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖均無(wú)明顯差別，與材料粘附好。各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)ALP活性及鈣含量均與BC組無(wú)差別。在體內(nèi)，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)菌組還是MRSA菌組的A小組術(shù)后材料與骨結(jié)合緊密，骨長(zhǎng)入明顯，骨缺損愈合，余小組材料與骨無(wú)明顯結(jié)合，骨缺損均未愈合，周?chē)枪琴|(zhì)疏松明顯。組織切片見(jiàn)A小組材料周?chē)z原纖維包裹，血管及編織骨形成，B小組骨水泥周?chē)匆?jiàn)膠原纖維及新骨形成，C小組可見(jiàn)少量膠原纖維及新骨形成。
　　結(jié)論：

10、
　　1、載本實(shí)驗(yàn)劑量的萬(wàn)古霉素BHA/PAA復(fù)合生物材料對(duì)L929細(xì)胞無(wú)毒性，具有良好的生物相容性。體內(nèi)萬(wàn)古霉素血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其中毒水平，無(wú)明顯全身中毒反應(yīng)，不影響動(dòng)物肝腎功能。完全符合ISO關(guān)于生物材料安全性規(guī)定
　　2、V-BHA/PAA材料加工制作過(guò)程對(duì)所載萬(wàn)古霉素?zé)o明顯破壞。其體外萬(wàn)古霉素釋放呈三相釋放模式，具有兩個(gè)釋放高峰，持續(xù)釋放時(shí)間可達(dá)到38天，最終藥物累積釋放達(dá)89.22%。體內(nèi)萬(wàn)古霉素釋放呈雙相，局部藥

11、物濃度高峰約在第14天，MIC90以上濃度持續(xù)將近42天
　　3、無(wú)論是體外、體內(nèi)V-BHA/PAA支架對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金葡菌及 MRSA菌均表現(xiàn)出一致的殺菌作用，明顯強(qiáng)于V-PMMA支架，其體外抑菌時(shí)間超過(guò)28天。在體內(nèi)其對(duì)慢性骨髓炎治愈率分別達(dá)到：75%（標(biāo)準(zhǔn)菌）和66.67%（MRSA菌），明顯高于V-PMMA(50%和41.67%)
　　4、在體外，載與不載萬(wàn)古霉素BHA/PAA材料均不影響MG63細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞與材料粘