人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選.pdf

1、目的：構(gòu)建天然人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)，并初步篩選出抗甲狀腺未分化癌抗體。
　　方法：提取ATC病人癌周淋巴結(jié)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以此cDNA為模板分別擴(kuò)增 VH、VL基因片斷，并與相應(yīng) Lin ker連接；再采取重疊延伸PCR技術(shù)拼接組裝成scFv基因片段。隨后引入酶切位點(diǎn)sfi I和Not I，連接經(jīng)雙酶切后的scFv重組基因片段與質(zhì)粒pCANTAB-5E。產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)入大腸桿菌 TG1，超感染噬菌體，構(gòu)

2、建噬菌體單鏈抗體庫(kù)。最后采用甲狀腺未分化癌細(xì)胞為抗原對(duì)建立的抗體庫(kù)進(jìn)行4輪“吸附、洗脫、擴(kuò)增”的篩選，并應(yīng)用ELS IA方法鑒定其特異性。
　　結(jié)果：成功獲得約為750 bp的sc F v基因。用p UC19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測(cè)定轉(zhuǎn)化效率達(dá)到108 c fu/μg，雙酶切鑒定 s cF v基因的陽(yáng)性插入率為86.4％(19/22)。經(jīng)過(guò)四輪親和篩選，針對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞的單鏈抗體得到明顯富集，第四輪收獲率為第一輪的77倍。ELS IA結(jié)果