過表達(dá)miR-148b對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響和作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肺癌是一類嚴(yán)重危害人類身體健康和生命的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下。肺癌重要成員之一的非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)常見惡性腫瘤，許多患者在診斷時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）治療方面雖然涌現(xiàn)出了許多低毒有效的新藥物，但NSCLC患者的總生存時(shí)間仍無法得到明顯延長(zhǎng)，故探索控制NSCLC的新方法具有重要的臨床意義?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生與發(fā)展常常伴隨著細(xì)胞生物學(xué)行為的異常改變。目前，在諸多

2、腫瘤中可檢測(cè)到異常表達(dá)甚至缺失的miRNA，這提示miRNA很可能具備促進(jìn)腫瘤或者抑制腫瘤的功能，在腫瘤的進(jìn)展中可能通過靶向調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因來發(fā)揮一定的作用。其中，許多研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在人類多種類型的腫瘤中呈低表達(dá)，并發(fā)揮類似抗癌基因的作用，然而， miR-148b對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響以及在非小細(xì)胞肺癌中潛在作用機(jī)制尚未得到充分探索。為了更好地了解miR-148b在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)意義，在前期研究中我們初步測(cè)定了miR-

3、148b在PC14/B和A549人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的功能，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺癌患者與正常肺組織中miR-148b的表達(dá)，進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-148b對(duì)NSCLC細(xì)胞株增殖、克隆形成能力以及侵襲能力均有抑制作用。此次，我們研究了miR-148b呈現(xiàn)過表達(dá)時(shí)對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步分析驗(yàn)證了其可能存在的作用機(jī)制。
　　研究方法：

4、　　(1)重組慢病毒載體構(gòu)建，病毒包裝與滴度檢測(cè)：將基因 miR-148b克隆至慢病毒rLv-miR-148b載體，作為miR-148b過表達(dá)組，將干擾miR-148b的表達(dá)的克隆至慢病毒rLv-NC載體，作為陰性對(duì)照組rLv-NC，分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得高滴度的慢病毒濃縮液；
　　(2)分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染病毒 rLv-miR-148b、病毒 rLv-NC和未重組慢病毒 Lv-Blank于PC14/B和A549細(xì)胞系，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞

5、株，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞的miR-148b表達(dá)量；
　　(3) CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、PI單染法細(xì)胞周期檢測(cè)、Annexin V-FITC/PI雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定改變miR148b的表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　研究結(jié)果：
　　(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細(xì)胞系中miR-148b的表達(dá)量，空白對(duì)照組為：PC14/B-Bl

6、ank、A549-Blank，陰性對(duì)照組為：PC14/B-NC、A549-NC，miR-148b過表達(dá)組為：PC14/B-miR-148b、A549-miR-148b；
　　(2)穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細(xì)胞的CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成測(cè)定顯示：與空白對(duì)照組相比，miR-148b的過表達(dá)顯著抑制PC14/B和A549細(xì)胞的增殖和集落形成，并且沉默miR-148b的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PC14/B和A549細(xì)胞中miR-148b

7、抑制細(xì)胞增殖和集落形成的作用；
　　(3) PC14/B和A549的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布顯示：與空白對(duì)照組相比，miR-148b過表達(dá)組，G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少，而沉默miR-148b表達(dá)組，G2/M期細(xì)胞顯著增加；
　　(4) Annexin V-FITC/PI雙染色后，通過流式細(xì)胞儀分析并量化轉(zhuǎn)染后PC14/B和A549細(xì)胞的凋亡率，根據(jù)各組的早期凋亡率發(fā)現(xiàn)miR-148b過表達(dá)細(xì)胞的凋亡率高于空白對(duì)照組，而沉默mi

8、R-148b表達(dá)的細(xì)胞凋亡率低于空白對(duì)照組；
　　(5)免疫印記實(shí)驗(yàn)分析顯示，與空白對(duì)照組比 miR-148b的過表達(dá)明顯降低 PC14/B和A549細(xì)胞中磷酸化JNK蛋白的表達(dá)，而JNK上游的刺激信號(hào)MKK4蛋白、MKK蛋白7和總的JNK蛋白的表達(dá)不受影響，并且沉默miR-148b的表達(dá)能夠重新激活JNK的磷酸化。
　　研究結(jié)論：
　　(1) miR-148b的過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖；
　　(2) miR