過表達(dá)miR-148b對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響和作用機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景和目的:
  肺癌是一類嚴(yán)重危害人類身體健康和生命的常見惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率居高不下。肺癌重要成員之一的非小細(xì)胞肺癌是我國(guó)常見惡性腫瘤,許多患者在診斷時(shí)就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來,在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療方面雖然涌現(xiàn)出了許多低毒有效的新藥物,但NSCLC患者的總生存時(shí)間仍無法得到明顯延長(zhǎng),故探索控制NSCLC的新方法具有重要的臨床意義?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生與發(fā)展常常伴隨著細(xì)胞生物學(xué)行為的異常改變。目前,在諸多

2、腫瘤中可檢測(cè)到異常表達(dá)甚至缺失的miRNA,這提示miRNA很可能具備促進(jìn)腫瘤或者抑制腫瘤的功能,在腫瘤的進(jìn)展中可能通過靶向調(diào)節(jié)原癌基因或抑癌基因來發(fā)揮一定的作用。其中,許多研究發(fā)現(xiàn)miR-148b在人類多種類型的腫瘤中呈低表達(dá),并發(fā)揮類似抗癌基因的作用,然而, miR-148b對(duì)腫瘤進(jìn)展的影響以及在非小細(xì)胞肺癌中潛在作用機(jī)制尚未得到充分探索。為了更好地了解miR-148b在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)意義,在前期研究中我們初步測(cè)定了miR-

3、148b在PC14/B和A549人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的功能,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺癌患者與正常肺組織中miR-148b的表達(dá),進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)miR-148b對(duì)NSCLC細(xì)胞株增殖、克隆形成能力以及侵襲能力均有抑制作用。此次,我們研究了miR-148b呈現(xiàn)過表達(dá)時(shí)對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并進(jìn)一步分析驗(yàn)證了其可能存在的作用機(jī)制。
  研究方法:

4、  (1)重組慢病毒載體構(gòu)建,病毒包裝與滴度檢測(cè):將基因 miR-148b克隆至慢病毒rLv-miR-148b載體,作為miR-148b過表達(dá)組,將干擾miR-148b的表達(dá)的克隆至慢病毒rLv-NC載體,作為陰性對(duì)照組rLv-NC,分別共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得高滴度的慢病毒濃縮液;
  (2)分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染病毒 rLv-miR-148b、病毒 rLv-NC和未重組慢病毒 Lv-Blank于PC14/B和A549細(xì)胞系,獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞

5、株,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組細(xì)胞的miR-148b表達(dá)量;
  (3) CCK-8法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、PI單染法細(xì)胞周期檢測(cè)、Annexin V-FITC/PI雙染色法細(xì)胞凋亡檢測(cè)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定改變miR148b的表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。
  研究結(jié)果:
  (1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細(xì)胞系中miR-148b的表達(dá)量,空白對(duì)照組為:PC14/B-Bl

6、ank、A549-Blank,陰性對(duì)照組為:PC14/B-NC、A549-NC,miR-148b過表達(dá)組為:PC14/B-miR-148b、A549-miR-148b;
  (2)穩(wěn)轉(zhuǎn)后PC14/B和A549細(xì)胞的CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成測(cè)定顯示:與空白對(duì)照組相比,miR-148b的過表達(dá)顯著抑制PC14/B和A549細(xì)胞的增殖和集落形成,并且沉默miR-148b的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PC14/B和A549細(xì)胞中miR-148b

7、抑制細(xì)胞增殖和集落形成的作用;
  (3) PC14/B和A549的細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布顯示:與空白對(duì)照組相比,miR-148b過表達(dá)組,G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少,而沉默miR-148b表達(dá)組,G2/M期細(xì)胞顯著增加;
  (4) Annexin V-FITC/PI雙染色后,通過流式細(xì)胞儀分析并量化轉(zhuǎn)染后PC14/B和A549細(xì)胞的凋亡率,根據(jù)各組的早期凋亡率發(fā)現(xiàn)miR-148b過表達(dá)細(xì)胞的凋亡率高于空白對(duì)照組,而沉默mi

8、R-148b表達(dá)的細(xì)胞凋亡率低于空白對(duì)照組;
  (5)免疫印記實(shí)驗(yàn)分析顯示,與空白對(duì)照組比 miR-148b的過表達(dá)明顯降低 PC14/B和A549細(xì)胞中磷酸化JNK蛋白的表達(dá),而JNK上游的刺激信號(hào)MKK4蛋白、MKK蛋白7和總的JNK蛋白的表達(dá)不受影響,并且沉默miR-148b的表達(dá)能夠重新激活JNK的磷酸化。
  研究結(jié)論:
  (1) miR-148b的過表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖;
  (2) miR

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