psm-mec在MRSE中的表達和功能研究.pdf

1、目的：定植人體皮膚表面的表皮葡萄球菌（ Staphylococcus epidermidis, S.epidermidis）是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌。當S.epidermidis在醫(yī)療設施中形成生物被膜后，可引起慢性感染和導管相關性感染，難以治愈，已引起醫(yī)學界廣泛關注。研究生物被膜形成機制對其治療具有指導意義。雖然調(diào)控S.epidermidis生物被膜的部分分子和相關機制已被闡釋，但激發(fā)其生物被膜形成的重要分子尚不清楚。近年來，國

2、外學者研究發(fā)現(xiàn)葡萄球菌染色體 mec基因盒（ Staphyloccoccal Cassette Chromosome mec, SCCmec）伴隨基因psm-mec能調(diào)節(jié)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ Methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA）生物被膜形成。在具有生物被膜形成能力的S.epidermidis標準菌株RP62A培養(yǎng)上清存在PSM-mec多肽，預實驗結果顯示攜帶 psm-

3、mec基因的耐甲氧西林表皮葡萄球菌（Methicillin resistant S. epidermidis, MRSE）具有生物被膜形成能力，提示psm-mec基因可能與MRSE生物被膜相關。但缺乏psm-mec在臨床分離S.epidermidis中表達和生物被膜形成的實驗證據(jù)，psm-mec基因是否參與 MRSE生物被膜形成尚不清楚。因此，本研究旨在分析psm-mec在臨床分離S.epidermidis中的表達和特征，通過缺失突變、

4、點突變和過表達 psm-mec基因，觀察突變和過表達后 S.epidermidis生物被膜形成及相關性狀的變化，探討該基因與 MRSE生物被膜形成的關系及其機制。
　　方法:
　　1分析psm-mec與臨床分離MRSE生物被膜的關系
　　1)攜帶psm-mec MRSE的篩選與確認：收集臨床分離S.epidermidis，通過分子生物學和微生物學方法確認攜帶psm-mec MRSE。
　　2）攜帶psm-mec

5、MRSE的分子特征：多重PCR分析psm-mec攜帶株SCCmec型別的多樣性；擴增基因間隔序列探討psm-mec與相鄰基因的連接關系；DNA序列比對分析psm-mec及其上游序列的變化；多重PCR分析攜帶psm-mec MRSE的agr型別，分析psm-mec與agr型別的關系。
　　3）psm-mec在MRSE中的表達：提取攜帶psm-mec MRSE總RNA，采用熒光定量RT-PCR分析臨床分離MRSE psm-mec轉錄表

6、達。
　　4）psm-mec與MRSE生物被膜的關系：半定量生物被膜檢測法分析攜帶與未攜帶psm-mec MRSE生物被膜形成能力，探討psm-mec與MRSE生物被膜的關系。
　　2研究psm-mec缺失突變與MRSE生物被膜的關系
　　1）篩選用于構建缺失突變的臨床菌株：運用藥敏實驗、DNA序列分析技術篩選psm-mec上下游序列與S.epidermidis標準菌株RP62A完全一致且四環(huán)素和氯霉素敏感的MRSE。

7、
　　2）psm-mec缺失突變株的構建：利用融合PCR和溫度敏感性穿梭質粒構建同源重組質粒pBT2-Δpsm-mec，經(jīng)鑒定后電轉金黃色葡萄球菌RN4220進行修飾，提取質粒后電轉用于構建缺失突變的臨床分離MRSE，經(jīng)同源重組后篩選和鑒定psm-mec缺失突變株。
　　3）psm-mec缺失突變與MRSE生物被膜的關系：分析缺失突變株與野生株生物被膜形成能力的差異，驗證psm-mec與MRSE生物被膜的關系。
　　3

8、探討psm-mec調(diào)控MRSE生物被膜的分子機制
　　1）研究psm-mec是通過其RNA和/或蛋白調(diào)控生物被膜：
　　構建psm-mec過表達株p221（mRNA和蛋白均表達），點突變株pM和pAG（mRNA表達，蛋白不表達），分析這些菌株生物被膜形成能力，探討psm-mec是在RNA和/或蛋白水平調(diào)控S.epidermidis生物被膜。
　　2）分析細菌起始粘附與psm-mec誘導生物被膜的關系：
　　細菌起

9、始粘附在生物被膜形成中具有重要作用，本實驗采用染色法和平板菌落計數(shù)法檢測p221，pM和pAG菌株起始粘附能力，分析其與psm-mec誘導生物被膜的關系。
　　3）探討eDNA與psm-mec誘導生物被膜的關系：
　　胞外DNA（eDNA）在形成和穩(wěn)定生物被膜中有重要作用，DNase I可降解eDNA。本實驗首先觀察DNase I對p221，pM和pAG菌株生物被膜的影響，驗證eDNA在S.epidermidis生物被膜形成

10、中的作用。分析p221，pM和pAG菌株生物被膜中eDNA的變化，探討eDNA與psm-mec誘導生物被膜的關系。
　　過表達和激活葡萄球菌自溶酶E（autolysin E, atlE）可誘導細菌自溶和eDNA的釋放。本實驗分析了p221，pM和pAG菌株atlE轉錄水平，自溶酶活性，Triton X-100誘導的自溶，對溶葡萄球菌酶敏感性的變化，探討其在psm-mec誘導生物被膜中的作用。
　　結果：
　　1. ps

11、m-mec主要分布于臨床分離agr I MRSE
　　83.64％的臨床分離 S.epidermidis為 MRSE，其中29株攜帶psm-mec基因，攜帶率為17.58%，且僅分布于MRSE中。90%攜帶psm-mec菌株為agr I型MRSE，10%為agr陰性突變株，未見其分布于agrⅡ或Ⅲ型MRSE。提示psm-mec主要分布于agr I MRSE。
　　2.攜帶psm-mec MRSE的分子特征
　　攜帶ps

12、m-mec菌株均為class A mec，但ccr分型表現(xiàn)出明顯的多樣性。多重PCR結果顯示攜帶psm-mec菌株存在8種SCCmec型別模式，且均為混合型，但所有菌株SCCmec中均含有Ⅱ或Ⅲ型片段。psm-mec與相鄰基因 mecR1, xylR存在兩種連接模式，100%菌株的psm-mec均與mecR1相連，68.97%菌株與xylR相連。所有菌株psm-mec ORF序列無突變，4.34%菌株在psm-mec基因上游SD區(qū)存在G

13、>A的點突變。
　　3.攜帶psm-mec MRSE均表達此基因
　　Real time逆轉錄PCR結果顯示，臨床分離攜帶psm-mec MRSE均可轉錄表達psm-mec，其表達水平在103-107拷貝之間，SD區(qū)G>A點突變和野生型菌株間psm-mec表達無差異，psm-mec與相鄰基因兩種連接方式間其表達也無差異，提示psm-mec SD區(qū)G>A點突變以及與相鄰基因連接方式不影響psm-mec轉錄表達。
　　4.

14、 psm-mec與MRSE生物被膜相關
　　攜帶與未攜帶 psm-mec菌株間生物被膜形成能力差異具有統(tǒng)計學意義，提示psm-mec與MRSE生物被膜相關。SD區(qū)G>A點突變和野生型菌株間生物被膜形成能力無差異，psm-mec與相鄰基因兩種連接方式間其生物被膜形成能力也無差異，提示psm-mec SD區(qū)G>A點突變以及與相鄰基因連接方式不影響生物被膜形成。
　　5. psm-mec缺失突變降低MRSE生物被膜形成
　　

15、序列比對和藥敏實驗篩選和鑒定了3株用于構建psm-mec缺失突變的臨床分離MRSE，通過同源重組，篩選和鑒定獲得psm-mec缺失突變株。與相應的野生株比較，3株缺失突變株生物被膜形成能力明顯降低，提示psm-mec可誘導MRSE生物被膜形成。
　　6. psm-mec mRNA調(diào)控S. epidermidis生物被膜
　　構建了psm-mec過表達株和不同點突變株p221, pM和pAG，并從DNA和RNA水平得到驗證。與

16、ATCC12228比較，p221, pM和pAG菌株生物被膜形成能力明顯增加，且p221與pM，pAG菌株生物被膜形成能力差異無統(tǒng)計學意義，提示 psm-mec mRNA調(diào)控 S. epidermidis生物被膜形成。
　　7.eDNA在psm-mec誘導S. epidermidis生物被膜中起重要作用
　　DNase I處理明顯降低p221, pM和pAG生物被膜形成能力。與ATCC12228比較，p221, pM和pAG

17、菌株生物被膜中eDNA含量明顯增加，agr下游分子atlE mRNA表達升高，同時自溶酶活性和TritonX-100誘導的自溶明顯增加，這些結果提示psm-mec可能通過細菌自溶釋放eDNA誘導生物被膜形成。
　　8.psm-mec不影響S. epidermidis起始粘附和溶葡萄球菌酶敏感性
　　與ATCC12228相比，p221, pM和pAG菌株的起始粘附能力和對溶葡萄球菌酶的敏感性的差異無統(tǒng)計學意義，提示細菌起始粘附