條斑紫菜原生質體轉基因的研究.pdf

1、紫菜養(yǎng)殖業(yè)是我國海藻養(yǎng)殖業(yè)的支柱產業(yè)之一，也是主要的出口創(chuàng)匯海產品。近年來，隨著紫菜栽培業(yè)規(guī)模的逐年擴大，對紫菜優(yōu)良品種的供應要求越來越高。紫菜易于養(yǎng)殖，藻體形態(tài)結構簡單，細胞發(fā)育分化易于調控，酶解紫菜產生原生質體及原生質體的再生技術已經成熟，易于進行分子水平上的研究。因此，開展紫菜基因工程研究，利用現(xiàn)代分子生物學的手段培育紫菜新品種是十分必要的，也具備現(xiàn)實可行性。同時，也有望將紫菜作為生物反應器來生產有用的外源蛋白。但是，目前紫菜的轉

2、基因研究還處于起始階段，主要是應用高等植物中常用的啟動子如CaMV 35S等研究報告基因在紫菜中的瞬間表達。因此，本論文以條斑紫菜(porphyra yezoensis)的營養(yǎng)體純系PY—qingdao1為材料，選擇條斑紫菜的內源β一微管蛋白(tubulin)基因的側翼序列為調控序列，通過微管蛋白基因及側翼序列的克隆和分析、表達載體的構建、基因轉化方法的建立等系統(tǒng)地進行了轉基因研究，初步建立其轉基因體系。 在本論文的前期研究中，

3、我們選取青島地區(qū)野生條斑紫菜，利用酶解制備原生質體進行再培養(yǎng)的方法培育了營養(yǎng)體純系PY—qingdaol。 根據(jù)真核細胞β一微管蛋白序列進行比對結果，設計簡并引物，采用針對高GC含量模板的PCR體系，從條斑紫菜PY Qingdao—l的基因組DNA中擴增出969bp的B一微管蛋白基因的部分序列，根據(jù)序列測定分析結果，設計反向PCR引物，并選用一系列在已知序列中不存在的識別位點的限制型內切酶對于條斑紫菜基因組。DNA進行酶切，然后

4、自連，以此為模板，進行反向PeR，克隆反向PCR片段并測序，序列拼接后共得到2799bp，提交到Genbank(AY221630)。其中編碼區(qū)1377bp，GC含量60.57％，比報道過的一些紅藻的β一微管蛋白基因編碼區(qū)GC含量高，共編碼458個氨基酸，沒有內含子，表現(xiàn)出很強的密碼子偏好性。其上游664bp序列GC含量高達66.42％，未發(fā)現(xiàn)TATA box，CAM、box等上游調控序列。其下游758bp的序列中沒有典型的AA[JAM．

5、polyA信號，只存在一個CAYTG的高等植物下游的保守序列。將推測的蛋白質全序列與Genbank中其他真核細胞的β一微管蛋白進行序列分析，構建進化樹，結果表明條斑紫菜與其他紅藻和真菌聚為一個簇群，而不與包括綠藻在內的綠色植物構成一個簇群。 通過PCR分別擴增得到含有B一微管蛋白基因編碼區(qū)上游序列663bp和下游序列337bp的兩個片段，構建了瞬間表達載體pATubGUS，通過電擊法轉化條斑紫菜原生質體，24小時后通過分光光度法

6、檢測到GUS基因的表達，且表達水平超過pBl221，說明β—微管蛋白基因的上游序列有啟動子活性，下游序列有終止子的作用。利用上游序列中的酶切位點構建瞬間表達載體pBITub5L、pBITtub5M和pBITub5S分別含有起始密碼子上游663bp、543bp和289bp的序列，結果證明663bp和543bp序列有啟動子活性，而289bp的序列基本無啟動子活性。通過PCR擴增得到含有終止密碼子下游337bp和431bp的片段，構建表達載體

7、pUCTubGUS和pUCTTubGUS31，瞬間表達的結果證明兩者都有終止子活性，而且對于瞬間表達水平沒有明顯的區(qū)別，推測AAGAAA(終止密碼子下游29l—296)在轉錄終止中起到了主要作用，CAYTG(終止密碼子下游416—420)對于條斑紫菜轉錄的終止作用可能影響不大，或3’調控序列337bp下游載體上類似序列起到相同的作用。 農桿菌介導的轉化除用于農桿菌天然的宿主，也成功應用于絲狀真菌、酵母、甚至人類培養(yǎng)細胞HeLa細

8、胞的基因轉化中。為在條斑紫菜原生質體中建立農桿菌介導的基因轉化方法，構建了農桿菌的雙元表達載體pCAMBIA330lTub5L，和pCAMBIAl302TubCAT。在100 μM乙酰丁香酮(AS)的誘導下，根癌農桿菌EHAl05(含有pCAMBIA302TubCAT)的與條斑紫菜原生質體共培養(yǎng)48小時后，進行氯霉素抗性篩選和脫菌處理，收集培養(yǎng)物，檢測到pCAMBIAl302TubCAT、轉化組中CAT的活性比對照組高，說明cat基因有

9、作為選擇標記基因的可能性。利用含有pCAMBIA3301或者pCAMBIA3301Tub5L的農桿菌EHAl05分別侵染原生質體，檢測到轉化組GUS的表達量高于對照組，而且pCAMBIA3301轉化組顯示出了更高GUS活性。證實農桿菌介導的轉化方法可以應用于條斑紫菜原生質體瞬間表達的研究。 綜上所述，本論文將反向PCR的技術首次應用于條斑紫菜β—微管蛋白基因及其側翼序列的克隆，分離了一個沒有內含子的B—微管蛋白基因的序列，并分析

10、其序列的特殊性。首次將內源β—微管蛋白基因的側翼序列用于條斑紫菜原生質體的瞬間表達，得到一個表達量明顯高于常用的CaMV 35S啟動子的內源性啟動子。并將農桿菌介導的基因轉化方法首次應用于條斑紫菜原生質體瞬間表達的研究，建立了簡便易行的農桿菌介導的條斑紫菜原生質體基因轉化的方法，其操作性明顯優(yōu)于現(xiàn)在的條斑紫菜原生質體轉化方法如電擊法、基因槍法等。這些研究為進一步通過轉基因的手段改良紫菜品種，實現(xiàn)以紫菜為生物反應器來大量生產外源蛋白奠定了