小白菊內(nèi)酯對(duì)糖尿病腎病小鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致DM患者死亡的主要原因。其早期的主要臨床表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨著病程的進(jìn)展就會(huì)出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球?yàn)V過(guò)率下降、腎功能下降等臨床表現(xiàn)，病程不可逆轉(zhuǎn)，最終發(fā)展成終末期腎病。病理變化是細(xì)胞外基質(zhì)成分積聚所致的腎小球肥大、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增寬，最后發(fā)展為腎小球硬化。因此，了解并探索DN的發(fā)

2、病機(jī)制及其病理生理變化，從而更好地防治DN，就成為了一個(gè)需要迫切解決的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)研究表明高血糖是導(dǎo)致DM慢性并發(fā)癥發(fā)生的起始因素，氧化應(yīng)激是DN發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，其可以與炎癥反應(yīng)相互作用，共同促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制目前仍未闡明。高血糖可能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而激活核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA結(jié)合，調(diào)控炎癥基因轉(zhuǎn)錄，如腫瘤壞死因子(tumor ne

3、crosis factor, TNF)-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP)-1、IL-1、IL-6、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM)-1、血管細(xì)胞黏附分子(vascular celladhesion molecule-1，VCAM)-1及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growthfactor-beta,TGF

4、)-β等，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積，從而促進(jìn)DN的發(fā)生與發(fā)展。
　　小白菊內(nèi)酯(parthenolide，PTL)是從菊科植物純化出的一種倍半萜烯內(nèi)酯類化合物，很多實(shí)驗(yàn)表明PTL是一種特異且強(qiáng)有效的NF-κB抑制劑，通過(guò)直接阻止NF-κB和（或）作用于IKK復(fù)合體，阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與目的基因結(jié)合，發(fā)揮抗偏頭痛、抗風(fēng)濕熱、抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等多種藥理作用。
　　目的：
　　本研究擬應(yīng)用DM模型db/db小鼠

5、，探討PTL對(duì)db/db小鼠DN的治療作用。
　　方法：
　　1.動(dòng)物分組及干預(yù)
　　選用8周齡的2型DM自發(fā)性動(dòng)物模型db/db小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)分為4組，分組依據(jù):平均體重和尿蛋白沒(méi)有異常，有異常的個(gè)體剔除，余下動(dòng)物按SPSS統(tǒng)計(jì)軟件完全隨機(jī)分組，從而達(dá)到各組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，每個(gè)動(dòng)物都有單一的編號(hào)，一直保持紀(jì)錄。將12只db/db小鼠分為模型組及PTL治療組，每組各6只;12只野生型db/m小鼠分為正常對(duì)照組及P

6、TL干預(yù)組，每組各6只。小鼠從第12周齡開始干預(yù)，治療組小鼠及PTL干預(yù)組采用PTL50 mg/(kg·d)進(jìn)行灌胃干預(yù)，模型組和正常對(duì)照組小鼠以等量藥物溶媒（5％乙醇）灌胃。
　　2.db/m小鼠及db/db小鼠一般情況觀察及尿蛋白排泄測(cè)定
　　觀察db/m小鼠及db/db小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)、飲食、飲水及健康情況并記錄，定期測(cè)定db/m小鼠及db/db小鼠體重、血糖、24小時(shí)尿微量白蛋白，連續(xù)治療12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死

7、全部小鼠，稱體重、腎重，留取24小時(shí)尿液檢測(cè)尿白蛋白排泄量。
　　3.db/m小鼠及db/db小鼠腎臟病理學(xué)檢查
　　連續(xù)治療12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死全部小鼠，留取db/m小鼠及db/db小鼠腎臟組織進(jìn)行HE、PAS染色并觀察腎組織形態(tài)學(xué)病理改變。
　　4.db/db小鼠腎臟損傷及藥物干預(yù)機(jī)制研究
　　免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TGF-β表達(dá)情況，免疫蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)8-羥基脫氧鳥苷（8-hyd

8、roxy deoxyguanosine，8-OHdG）與NF-κB的蛋白表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)與熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)MCP-1表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X)±S表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，開始對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);多組間比較:如果符合正態(tài)分布(p＞0.05及方差齊(p＞0.05），采用單因素方差分析的LSD法進(jìn)行多重比較，(p＜0

9、.05）認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;如果不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的K-ruskal.Wallis H方法，如果K-ruskal.Wallis H檢驗(yàn)結(jié)果顯著(p＜0.05），再將數(shù)據(jù)進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行多組間兩兩比較，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.飼養(yǎng)期間，模型組db/db小鼠與正常組db/m小鼠比較，表現(xiàn)出明顯的多飲、多食、多尿、體型肥胖。24周齡實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，db/db小鼠24小時(shí)尿白蛋白排泄量

10、與肌酐比值及腎臟指數(shù)較db/m小鼠明顯增高(p＜0.05)，db/db小鼠經(jīng)過(guò)藥物PTL50mg/(kg·d)的治療后，24小時(shí)尿白蛋白排泄量與肌酐比值增高現(xiàn)象明顯得以改善，腎臟指數(shù)亦明顯下降(p＜0.05)。但PTL對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。
　　2.病理組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示db/db小鼠腎臟組織腎小球體積增大明顯，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)增多，部分腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，PAS紅染區(qū)擴(kuò)大;而正

11、常組小鼠腎組織無(wú)明顯上述變化。而經(jīng)PTL50mg/(kg·d)治療后，db/db小鼠腎組織上述病變明顯改善，基質(zhì)積聚、沉積減輕和系膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，但尚未恢復(fù)至正常狀態(tài)。
　　3.免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與db/m小鼠比較，db/db組小鼠腎組織TGF-β蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05)，經(jīng)PTL治療后，db/db小鼠腎組織TGF-β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與db/m小鼠比較，

12、db/db小鼠腎組織8-OHdG蛋白表達(dá)明顯上升(p＜0.05)，而經(jīng)PTL治療后，db/db+PTL組小鼠腎組織8-OHdG蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)，但較db/m組小鼠表達(dá)上升(p＜0.05)，8-OHdG蛋白表達(dá)在db/m和db/m+PTL兩組小鼠腎組織中表達(dá)變化不明顯(p＞0.05)。
　　5.Western blot結(jié)果顯示，與db/m小鼠比較，db/db組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05)，經(jīng)P

13、TL治療后，db/db小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　6.ELISA結(jié)果顯示，與db/m小鼠比較，db/db小鼠腎組織MCP-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.05)，經(jīng)PTL治療后，db/db小鼠腎組織MCP-1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(p＜0.05)。
　　7.qRT-PCR結(jié)果顯示，PTL可明顯下調(diào)db/db小鼠腎組織MCP-1mRNA表達(dá)(p＜0.05)，這與蛋白水平檢測(cè)腎臟組織MCP-1表達(dá)的結(jié)果相一