SATB1通過改變核定位調控β-類珠蛋白基因表達.pdf

1、細胞核是復雜的有機體，包含各種各樣動態(tài)分布的內容物。但是最新的實驗結果顯示細胞核其實是有序排布的，即使在有絲分裂的間期當染色質成疏松伸展狀態(tài)存在時，也并不是想象中那樣散亂分布。SKY技術利用不同熒光對不同染色體進行標記并將熒光轉為光譜進而用精密儀器進行分析。分析結果顯示不同染色體在細胞核內占有特定的空間區(qū)域，稱為染色體區(qū)域。進一步實驗分析還指出長時間沉默的基因以及大量的基因荒漠區(qū)通常位于染色體區(qū)域的內部，而活性表達的基因往往分布在染色體

2、區(qū)域的表面，甚至環(huán)出，這與染色體間區(qū)分布有大量基因表達所需的調控復合物有關，這就是著名的CT-IC模型的基礎理論。因此基因在細胞核內的定位就由原來簡單分為異染色質區(qū)和常染色質區(qū)發(fā)展得更為深入了，基因在細胞核內的定位以及位置的變化與基因表達調控之間的關系也越來越受到重視。除了基因與自己所處的染色體區(qū)域之間的定位關系與基因表達水平有著密切的調控關系，實驗還發(fā)現，基因與核周邊或核中心區(qū)域的距離也具有基因表達調控功能。另外核基質作為細胞核內重要

3、的結構，募集了大量與調控相關的轉錄因子和酶，實驗結果發(fā)現與核基質的結合狀況也與基因活化狀況相關。因此基因在細胞核內不是隨意排布的，定位往往與基因表達狀態(tài)息息相關。 眾所周知數以萬計的基因并不是任何時間或在任何組織中都表達，組織特異性與發(fā)育階段特異性是基因表達的重要特性，也是維持正常個體發(fā)育和細胞分化并行使正確功能的保障，無論是基因的表達時間還是組織發(fā)生紊亂都會導致細胞功能失常誘發(fā)疾病。既然基因的核定位對基因表達存在調控作用，那是

4、否基因的核定位也相應地存在組織特異性和發(fā)育階段特異性呢?實驗結果證實了這種假想。基因在核內的定位是隨著基因的活化與抑制而動態(tài)變化的。處于染色質內部或表面的基因在活化之后會向表面移動或是環(huán)出，而原本環(huán)出的基因則會在表達水平下降之后環(huán)進染色體區(qū)域。活性表達的基因往往會遠離異染色質區(qū)域向常染色質區(qū)域靠近，而表達受抑制的基因則會向異染色質區(qū)域靠近更是早已發(fā)現的現象。基因與核基質的結合其實也是動態(tài)變化的，染色質DNA通過許多核基質結合序列與核基質

5、結合，但是并不是所有的這些核基質結合序列都會與核基質結合，而是根據相鄰的基因表達狀態(tài)有選擇的結合，而且當基因的表達狀況在受到誘導前后發(fā)生變化后，與核基質結合的核基質結合序列也會發(fā)生變化，這一點也更加證實了核基質并不單純是固定染色質的核內結構，它與基因的表達調控是密切相關的。 目前對于珠蛋白基因簇在核內的定位調控也有了一些認識，但是并不深入，多是集中在LCR對于β-珠蛋白基因簇核內定位的調控。我們的實驗旨在探索珠蛋白基因簇在核內的

6、定位以及該定位與核基質的關系。SATB1蛋白是近幾年發(fā)現的T細胞特異性表達的核基質結合蛋白，在其它細胞中少有表達。SATB1蛋白可以相互聚合形成鳥籠樣結構，并且此籠形結構的形成與和核基質正確結合是密切相關的，這不僅為基因表達調控提供平臺，而且介導了基因與核基質的結合，接受核基質上募集的調控因子的調控。有實驗發(fā)現在人紅白血病細胞系K562中過表達SATB1蛋白，可以促進β-珠蛋白基因簇的活化，尤其促進胚胎型的基因表達。主要機理是在β-珠蛋

7、白基因簇LCR區(qū)的HS2上以及ε基因的增強子區(qū)域有SATB1蛋白的結合位點，因此SATB1蛋白募集的一些去乙?；种泼傅热旧|修飾蛋白就可以作用于這兩點的染色質使其開放，促進基因表達。由于如前所述，SATB1形成的籠形結構可以募集染色質修飾蛋白，而且此作用與核基質密切相關，因此我們假設SATB1蛋白對于珠蛋白基因的調控可能與促使β-珠蛋白基因簇改變核定位有關，而這種核定位的變化有可能與同核基質結合密不可分。 為了證明我們的設想，

8、我們構建了SATB1表達載體以及刪除了核基質結合區(qū)的突變SATB1的表達載體，并分別轉染K562細胞，獲得穩(wěn)定克隆后進行珠蛋白基因簇的定位分析。首先β-類珠蛋白基因的表達水平檢測發(fā)現，SATB1過表達后可以增加ε基因表達而降低γ基因的表達，這與以前的實驗結果吻合。而且與我們預期一致的是，在SATB1突變表達后這種調控結果減弱了。因此提示SATB1對于珠蛋白基因的表達調控可能與核基質的作用相關。然后，我們利用FISH技術觀察了SATB1過

9、表達及突變表達的情況下β-珠蛋白基因簇的核內定位情況。先以11號染色體區(qū)域為內對照觀察，結果發(fā)現SATB1過表達后30％的β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出，與hemin誘導的K562細胞進行的陽性對照中的37％環(huán)出的結果相接近。但是出乎意料的是，在SATB1突變表達后，同樣有33％的β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出。根據兩種情況下珠蛋白基因表達水平的不同以及我們所做的突變分析，這兩種情況下的核定位應該是有區(qū)別的。于是我們又以核基質進行內對照，對β-

10、珠蛋白基因簇的核定位進行觀察。結果發(fā)現，在SATB1過表達時，大部分β-珠蛋白基因簇是與核基質結合的，而當SATB1突變表達之后，雖然β-珠蛋白基因簇發(fā)生了環(huán)出，但是并不與核基質結合，而是處于核暈的部位。這與以往的實驗發(fā)現用紅系不表達的IgG基因簇上的LCR替代β-珠蛋白基因簇原位的LCR之后雖然促使了珠蛋白基因簇的環(huán)出，但是并不能轉位使其遠離異染色質區(qū)也不能促進珠蛋白基因的表達有相似之處。因此提示，β-珠蛋白基因簇的環(huán)出是調控珠蛋白基

11、因表達的必要非充分條件，環(huán)出之后的具體定位也起重要作用。 另外由于核基質有多種轉錄調節(jié)因子結合，那么與核基質的不同結合狀態(tài)是否會改變β-珠蛋白基因簇與重要反式因子的結合狀況?我們利用ChIP技術觀察β-珠蛋白基因簇與PolⅡ與GATA1的結合狀態(tài)。結果發(fā)現，SATB1過表達后增加了HS2區(qū)域和￡基因的啟動子區(qū)與PolⅡ的結合幾率，同時降低了丫基因的啟動子區(qū)與PolⅡ的結合幾率。而在SATB1突變表達的情況下，三個觀察點上的Pol

12、Ⅱ結合幾率與正常K562細胞對照沒有明顯差別。關于GATA1，實驗發(fā)現SATB1過表達后增加了HS2區(qū)域和GATA1的結合幾率，但是降低了ε基因和γ基因GATA1結合位點的結合幾率；而在SATB1突變表達的情況下，HS2區(qū)域和GATA1的結合幾率降低了，ε基因與GATA1的結合幾率沒有明顯規(guī)律，而γ基因的結合情況與正常對照沒有差別.此結果與半定量PCR發(fā)現的正常SATB1蛋白促進胚胎期珠蛋白基因表達而降低胎兒期珠蛋白基因表達，突變SAT

13、B1蛋白不具有此調控效果的結果相一致，也提示SATB1蛋白可能通過介導β-珠蛋白基因簇與核基質的結合，改變與調控因子的結合狀態(tài)從而調控珠蛋白基因表達。 基于我們的研究，我們提出關于SATB1調控β-珠蛋白基因簇機制模型的假想：SATB1蛋白相互聚合形成籠形結構，在聚合過程中促使與之結合的β-珠蛋白基因簇環(huán)出11號染色體區(qū)域，并且介導β-珠蛋白基因簇與核基質的結合。并且由于SATB1蛋白的結合位點主要是在HS2區(qū)域和ε基因的近端調