低免疫原性葡激酶的構建及功能分析.pdf

1、天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是溶原性金黃色葡萄球菌合成的一種單鏈蛋白，由136個氨基酸組成，其中包括45個帶電氨基酸殘基不含半胱氨酸及二硫鍵，分子量15.5kDa。研究發(fā)現SAK可以選擇性的作用于纖維蛋白原。SAK具有纖維蛋白特異性高，對血小板富集型血栓作用強等優(yōu)點。與同期上市的溶栓藥物相比具有溶栓效果好，專一性強，副作用小，價格便宜等優(yōu)點。我室研制的重組葡激酶(rSAK)已經完成二期臨床實驗，對急性心梗的治療結果

2、表明，rSAK的再通率顯著高于r-tPA，顯示出良好的臨床應用前景。但是SAK作為一種細菌源性蛋白，在用藥后兩周產生大量中和性抗體，影響其重復使用。在一定程度上限制了其臨床應用范圍。 對SAK分子進行修飾，改造其抗原表位，是獲得新型低免疫原性溶栓藥物的重要方法之一。本研究利用Biosun軟件，對我室的野生型SAK(wild typestaphylokinase，wtSAK)的抗原表位進行了預測，并結合SAK晶體結構和對其抗原表位

3、研究的報道，選擇了多個位點的氨基酸進行了缺失和突變，構建了10個SAK的突變體。結合SAK突變體活性和表達情況對其進行了篩選。從中選擇了突變體SAK2進行了表達和純化工藝的研究，進一步對其活性和免疫原性進行了分析和評價。主要研究內容和實驗結果如下： 1．SAK系列突變體的構建，表達，純化及活性分析 利用重疊延伸PCR方法，構建了N端缺失及特定位點突變的系列SAK突變體(SAK1-SAK10)。將編碼突變體基因的DNA片段

4、重組入表達載體pBV220，轉化E.coliBL21感受態(tài)細胞進行誘導表達。結果顯示，SAK1-SAK10在Ecoli/pBV220受體菌中均以包涵體形式表達。選擇突變位點較多的SAK1，SAK2，SAK7及SAK8重組入pET17b載體中，轉化E.coliBL21感受態(tài)細胞，誘導表達后以可溶性形式表達。活性檢測結果顯示突變體SAK2的溶栓活性與wtSAK相當，而其余突變體的活性與野生型SAK(wtSAK)相比均有所下降。 2．

5、SAK2大規(guī)模制備工藝的研究，多克隆抗體制備及抗原抗體反應性比較 將E.coliBL21/pET17b-SAK2菌株進行發(fā)酵，大量表達后，進行純化。經過陰離子交換層析和凝膠過濾層析兩步純化，SAK2純度達95％以上。使用纖維蛋白平板溶圈法檢測SAK2活性，其活性達到(3.5±1.4)×10<'-4>AU/mg，與野生型SAK活性(4.1±0.8)×10<'-4>AU/mg相當。 經過兩次加強免疫，制備wtSAK和SAK2

6、的兔源多抗，抗血清的滴度達到1×10<'7>時取血。用ELISA檢測抗原抗體的反應性；使用纖維蛋白平板溶圈法檢測兔抗wtSAK抗血清分別與wtSAK和SAK2結合后的蛋白溶栓活性。實驗結果證明SAK2與兔抗wtSAK抗體的反應性顯著下降，與兔抗wtSAK結合后的溶栓活性下降程度顯著低于wtSAK，說明wtSAK中的部分抗原表位已被缺失。 使用飽和硫酸胺沉淀法粗提兔抗wtSAK和兔抗SAK2，再用DEAE柱陰離子交換純化IgG抗體

7、，得到兔抗wtSAK和兔抗SAK2多克隆抗體。經ELISA法檢測抗體滴度為1×10<'5>。 3．wtSAK和SAK2在獼猴體內產生抗體的比較 以獼猴作為實驗動物，選擇小劑量多次給藥的給藥方案：使用0.02mg/kg體重劑量；隔天給藥；給藥七次持續(xù)兩周。停止給藥后十周再次給藥，給藥方案與第一次相同，給藥結束后觀察十一周。整個過程中選擇15個時間點采血，使用ELISA方法檢測獼猴血清中抗體水平。選擇抗體水平最高的時間點檢測

8、血清的中和活性。對wtSAK組和SAK2組的抗體水平檢測結果說明兩組整體的抗體變化趨勢基本一致，均在第二輪給藥期出現抗體水平的明顯升高，但SAK2組抗體水平顯著低于wtSAK組。wtSAK組在第一輪給藥中出現了抗體水平的小幅升高，而SAK2組抗體水平在第一輪給藥期無明顯變化。wtSAK和SAK2分別和各自的獼猴抗血清溫育結合后，wtSAK的溶栓活性僅保持了3.8％，而SAK2的殘余溶栓活性為75.3％。以上結果說明在小劑量反復給藥方案下

9、SAK2的效果優(yōu)于wtSAK。在給藥期和觀察期共6個月的時間內SAK2的活性受其抗體影響較小。 4．小劑量反復用藥方案對機體血纖溶系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的影響 在反復多次給藥的6個月觀察期內，選擇反映血凝的指標PT，APTT，TT，和反映纖維蛋白溶解系統(tǒng)的指標FIB，PLG，α<,2>-PI進行檢測。結果顯示以上各指標在用藥過程中均無顯著變化。 綜上所述，我們設計構建了SAK的系列突變體；篩選并獲得了活性較高，抗原性降低