大腸桿菌不耐熱腸毒素LT在煙草中的表達.pdf

1、不耐熱腸毒素(Heatlabileenterotoxin，LT)是腸產毒性大腸桿菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)分泌的一種熱不穩(wěn)定性腸毒素。它是由A、B兩種亞單位組成的AB5型雜六聚體蛋白，是目前人們發(fā)現的最強有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐劑之一。然而，已有的研究發(fā)現，不論是LTB的N端還是C端融合抗原，雖然能夠形成正常的五聚體，且具有受體的親合活性。但形成五聚體的效率并與細胞表面受體結合能力以及五聚體化學穩(wěn)定性

2、，都會受到很大的影響，從而降低了其作為抗原傳輸載體的效能。 動物免疫實驗證實，LT全毒素分子明顯比B亞單位五聚體有更強的免疫原性。人們研究了A、B亞基對佐劑作用的影響。發(fā)現單獨的LTB與靶抗原同時口服后，佐劑作用不明顯，而微量全毒素LT同抗原共同口服后，表現出很強的佐劑作用。 當前，對減毒LT在煙草植物葉綠體中的表達已有研究，但還未見大腸桿菌腸毒素LT在植物胞質中表達的報道。本實驗研究的目的是將從K88ac+強致病菌株中

3、克隆的LTA、LTB基因，構建成兩種雙價植物高效表達載體，其中一種是將LTA、LTB基因單獨構建到兩個表達框。另一種是利用三引物PCR法(TP-PCR)技術，將擬南芥(Arabidopsis)泛素基因與煙草病程相關蛋白PRla基因的信號肽序列體外重組；并將重組的融合基因分別定向克隆到兩目的基因前。有實驗證實此融合蛋白的引入可增強外源基因在植物體內的表達。然后利用植物表達載體成功構建了帶有此融合基因不耐熱腸毒素A、B亞單位基因雙價植物表達

4、載體pCUPAB。最終將重組子轉化煙草，經卡那霉素(Kan)多重篩選，獲得抗性植株。對抗性植株提取DNA進行PCR分析，90％抗性植株均呈陽性。隨機選取幾株生長良好的PCR檢測為陽性的植株進行Westerndot檢測和蛋白表達分析，以驗證六聚體和五聚體的整合效果。結果在進行Westerndot檢測時只有少數樣品出現雜交信號。 本實驗結果表明LT全毒素在植物胞質中能正確組裝。此研究為進一步構建帶有保護性抗原類全毒素嵌合植物疫苗奠定