應用全基因組siRNA文庫篩選黑色素瘤耐藥細胞株及其機制研究.pdf

1、目的：2011年 FDA批準 BRAF抑制劑維羅非尼用于治療 BRAF V600E突變以及晚期不能手術(shù)切除的黑素瘤患者。該藥在經(jīng)過一段臨床實踐治療后，普遍產(chǎn)生耐藥性。針對此問題，我們構(gòu)建覆蓋人基因組的siRNA文庫質(zhì)粒、運用siRNA文庫篩選耐藥黑色素瘤細胞株、高通量測序、測序后單一片段功能的驗證以及逆轉(zhuǎn)錄病毒感染條件的探索這個5個方面進行了研究。以期待能從基因沉默這一方面進一步闡述臨床腫瘤耐藥機制。
　　方法：通過化學法合成中間

2、含有19個堿基隨機排列的片段，以PCR擴增該片段互補序列形成雙鏈DNA，并作為Gibson組裝的插入片段。在此基礎上，在逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架 pSOK質(zhì)粒的特定位置通過 Gibson Assembly的方法，將含有隨機排列19個堿基的siRNA片段組裝進入該質(zhì)粒并進行相關(guān)鑒定。
　　選取伴有 BRAF V600E突變的黑色素瘤細胞株 A375、MDA-MB-435和 UACC62三種細胞。利用 FDA批準用于治療伴有BRAF V600E

3、突變的黑色素瘤藥物維羅非尼和曲美替尼進行文庫篩選。確定細胞致死劑量后經(jīng)siRNA文庫篩選耐藥細胞株，經(jīng)結(jié)晶紫染色、IC50檢測、Q-PCR檢測耐藥相關(guān)基因、EMT相關(guān)基因等進行各個方面的驗證。同時，我們對篩選得到的耐藥細胞株提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴增測序片段后送檢Illumina HiSeq測序平臺進行檢測。根據(jù)測序結(jié)果設計11對單一序列過表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染細胞構(gòu)建單一片段過表達穩(wěn)定細胞株，并進行耐藥相關(guān)檢測。
　　為確保每個目

4、的細胞有且只有一個逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染，設計了2種逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒(帶G418抗性的pSEN-GFP質(zhì)粒以及帶BSD抗性的pSEB-RFP質(zhì)粒)，同時檢測病毒滴度、最佳感染時間和病毒儲存時間穩(wěn)定性等相關(guān)問題。
　　結(jié)果：
　　1.該siRNA文庫質(zhì)粒一次組裝數(shù)目約1.08x106，同時插入文庫片段質(zhì)粒的陽性率為91.7％，并且隨機挑選的15個陽性菌落質(zhì)粒測序沒有發(fā)生重疊。實驗結(jié)果表明，該siRNA文庫質(zhì)粒已充分覆蓋人基因組。

5、>　　2.維羅非尼對 UACC62的致死劑量為50uM，而 A375和MDA-MB-435細胞的致死劑量皆為25uM。曲美替尼對三種細胞的致死劑量為20uM。
　　3.依次使用抗腫瘤藥維羅非尼和曲美替尼的致死劑量對感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫的 A375細胞進行了篩選，分別成功篩選出 A375V、A375T、A375VT和A375TV耐藥細胞株。
　　4.與對照組A375相比，耐維羅非尼細胞A375V對達拉非尼(靶向BRAF蛋白)、

6、曲美替尼(靶向 MEK蛋白)以及順鉑和吉西他濱(二者皆為臨床一線細胞毒性藥物)藥物具有更強的耐藥性。
　　5.對照組細胞A375和A375n19的IC50為0.18 uM， A375V的半數(shù)致死劑量大大提升至5.09uM。
　　6. Tq-PCR檢測結(jié)果顯示，隨機挑選的13個耐藥相關(guān)基因、RAS/RAF/MEK信號通路相關(guān)基因在耐藥細胞株(A375V、A375T、A375VT和 A375TV)中呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢。EMT相關(guān)基

7、因 CDH1、CDH2、VIM、FOX2、Snail1和OCLN基因在耐藥細胞株中的表達也呈上調(diào)趨勢。
　　7.成功提取耐藥細胞株的基因組 DNA并設計測序引物進行 PCR擴增以送檢Illumina HiSeq測序平臺進行檢測。
　　8.隨機挑選了11個單一siRNA片段，9種片段的導入都能夠增加原細胞A375的耐藥性，實驗結(jié)果也通過結(jié)晶紫染色進行了驗證。
　　9.隨機挑選的耐藥相關(guān)基因、RAS/RAF/MEK信號通路

8、以及EMT相關(guān)基因的表達情況在A375TBRs(過表達單一siRNA片段)中都呈上調(diào)趨勢。
　　10.挑選耐藥細胞株測序所得峰度值最高的5個siRNA片段，并經(jīng)生物信息學分析確定這些片段的下游基因，這些基因在耐藥細胞株(A375V、A375T、A375VT和A375TV)和A375TBRs中都呈上調(diào)趨勢。
　　11.選取TBR1、TBR3和TBR8(三種siRNA片段)靶向的ncRNA設計了相應的引物(ncRNA-1到 nc

9、RNA-25)，經(jīng) Tq-PCR檢測，這些ncRNAs在耐藥細胞株(A375V、A375T、A375VT和 A375TV)和A375TBR3/5/7/8/9/10中都呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。
　　12.逆轉(zhuǎn)錄病毒最佳收集時間為病毒包裝后36h、48h、60h以及72h，感染A375細胞的最佳時間為4h左右。
　　13.隨著逆轉(zhuǎn)錄病毒儲存時間的延長，所有病毒組的病毒滴度都呈逐漸下降趨勢，4天后下降趨勢最為明顯。
　　14.在相同逆