虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素組學(xué)分析與幾種蜘蛛多肽毒素的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究.pdf

1、虎紋捕鳥(niǎo)蛛(Ornithoctonus huwena Wang)是中國(guó)南方發(fā)現(xiàn)的一種具有很強(qiáng)毒性的蜘蛛新種。本實(shí)驗(yàn)室前面的研究中已經(jīng)從中鑒定到十多種具有不同生物學(xué)活性的毒素組分。本文通過(guò)蛋白質(zhì)組分析方法結(jié)合多維色譜技術(shù)對(duì)虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒進(jìn)行了一個(gè)系統(tǒng)的、全面的毒素組學(xué)分析。粗毒通過(guò)分子篩被分為兩個(gè)部分：分子量10kDa以上的蛋白質(zhì)和分子量10kDa以下的多肽組分。對(duì)分子量10kDa以上的蛋白質(zhì)，利用2-DE分離，PDQUEST軟件分析，發(fā)

2、現(xiàn)了大約300個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；同時(shí)我們對(duì)這些組分也進(jìn)行1DE分離。對(duì)所有1DE條帶和2DE膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行酶解，質(zhì)譜(MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF)鑒定，一共準(zhǔn)確鑒定到90種蛋白質(zhì)，包括一些具有重要生物學(xué)意義的酶、結(jié)合蛋白質(zhì)和調(diào)控蛋白質(zhì)等。通過(guò)陽(yáng)離子交換和反相高效液相色譜柱層析(HPLC)對(duì)10kDa以下的多肽組分進(jìn)一步純化，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定到133種組分，并利用Edman降解技術(shù)得到了其中47種多肽序列，這些

3、多肽序列與其它動(dòng)物毒液中的多肽序列相似性很低，并且表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，這也表明了虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒液的獨(dú)特性。進(jìn)化分析表明這些多肽可以分為幾個(gè)超家族，并且在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因復(fù)制和定點(diǎn)突變。 Huwentoxin-Ⅺ(HWTX-Ⅺ)是從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中純化得到的一種雙功能多肽毒素，兼有絲氨酸蛋白酶抑制活性和鉀離子通道阻斷活性。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定和Edman降解測(cè)序結(jié)果表明：HWTX-Ⅺ由55個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為

4、6166.2Da。三維結(jié)構(gòu)解析表明HWTX-Ⅺ屬于Kunitz蛋白家族，六個(gè)半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的方式形成三對(duì)二硫鍵。通過(guò)表面等離子共振技術(shù)測(cè)得HWTX-Ⅺ與胰蛋白酶的解離常數(shù)為<1×10<'12> M，與胰凝乳蛋白酶的解離常數(shù)為1.56×10<'-7> M；利用等溫滴定量熱法準(zhǔn)確測(cè)定HWTX-Ⅺ與胰蛋白酶的解離常數(shù)為8.92×10<'12> M。HWTX-Ⅺ對(duì)DRG細(xì)胞上的鈣通道和鈉通道沒(méi)有作用，但能夠抑制DRG上的外向延

5、遲整流鉀電流。電壓鉗實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明HWTX-Ⅺ能夠抑制表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的Kv1.1電流，半抑制濃度為2.57 μ M，對(duì)Kv1.2和Kv1.3電流也有比較弱的抑制作用，這種抑制具有電壓依賴(lài)性。我們采用RACE的方法獲得了HWTX-Ⅺ的cDNA序列，根據(jù)結(jié)構(gòu)解析的結(jié)果在可能的活性區(qū)域設(shè)計(jì)了18個(gè)突變體，并使用載體pVT102U實(shí)現(xiàn)了在釀酒酵母中的表達(dá)。其中Lys14突變?yōu)锳1a后HWTX-Ⅺ沒(méi)有表現(xiàn)出胰蛋白酶抑制活性，突變體S16R、

6、R12P和G36R的酶抑制活性下降1～3倍，而突變體R10T的酶抑制活性上升了大約6倍，這些結(jié)果表明Lys14是HWTX-Ⅺ的關(guān)鍵活性殘基，臨近的幾個(gè)殘基是胰蛋白酶抑制活性的重要?dú)埢@些殘基突變不影響HWTX-Ⅺ的鉀通道活性。HWTX-Ⅺ的鉀通道活性區(qū)域在N-端和β-轉(zhuǎn)角區(qū)，突變體L6Y、L6A使HWTX-Ⅺ的鉀通道活性幾乎完全喪失，Arg5和Arg25突變?yōu)锳1a使毒素的通道活性分別下降了14倍和4倍；T3L、T3Y、G24W和G2

7、4Q的突變使毒素活性下降2～10倍，這部分殘基的突變不影響它們的蛋白酶抑制活性，證明這兩個(gè)功能區(qū)域是完全獨(dú)立的。HWTX-Ⅺ的研究為Kunitz超家族多肽毒素的進(jìn)化提供了非常有價(jià)值的線(xiàn)索。敬釗纓毛蛛(Chilobrachys jingzhao)是最近在我國(guó)海南省發(fā)現(xiàn)的一種蜘蛛新種。結(jié)合陽(yáng)離子交換和反相HPLC的方法，我們從其粗毒中純化到三種新的毒素多肽，并命名為敬釗纓毛蛛毒素-Ⅺ(JZTX-Ⅺ)、敬釗纓毛蛛毒素-Ⅻ(JZTX-Ⅻ)和敬釗

8、纓毛蛛毒素-ⅩⅢ(JZTX-ⅩⅢ)。MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定和Edman降解測(cè)序結(jié)果表明：JZTX-Ⅺ、JZTX-Ⅻ和JZTX-ⅩⅢ都是單鏈多肽分子，分子量分別為3726.38、3665.4和4122.5 Da，由34、29和35個(gè)氨基酸殘基組成，6個(gè)Cys形成三對(duì)二硫鍵。利用雙電極桿電壓鉗技術(shù)我們鑒定了這三種毒素及其它三種敬釗纓毛蛛毒素(敬釗纓毛蛛毒素-Ⅰ(JZTX-Ⅰ)、敬釗纓毛蛛毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)和敬釗纓毛蛛毒素-Ⅴ(JZ

9、TX-Ⅴ))對(duì)鉀離子通道的影響特征。電壓鉗結(jié)果表明這六種毒素都以調(diào)制通道門(mén)控特征的方式作用于Kv2和Kv4通道，但對(duì)這兩種通道家族表現(xiàn)出不同的親和力和通道亞型的不同選擇性。JZTX-Ⅺ和JZTX-Ⅲ是Kv2通道抑制劑，JZTX-Ⅴ和JZTX-Ⅻ屬于Kv4通道毒素，對(duì)Kv2.01表現(xiàn)出比較弱的抑制作用，但JZTX-Ⅰ和JZTX-ⅩⅢ表現(xiàn)出同等程度的Kv2和Kv4通道親和力。這些毒素的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究表明，毒素分子表面活性區(qū)域的電荷分布差

10、異導(dǎo)致的靜電各向異性是毒素對(duì)離子通道不同選擇性的關(guān)鍵因素。抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，在半有效量的毒素濃度下，它們的抑制動(dòng)力學(xué)有很大的差別。JZTX-Ⅴ表現(xiàn)出最快的抑制速度(抑制常數(shù)為τ≈9.5 s)，這種抑制是可逆的，把毒素洗脫掉以后，電流以非?？斓乃俣然謴?fù)到對(duì)照水平(時(shí)間常數(shù)為15 s)，另外五種毒素都表現(xiàn)出通道毒素的慢抑制動(dòng)力學(xué)特征。針對(duì)這六種毒素的不同離子通道選擇性和動(dòng)力學(xué)特征，我們進(jìn)行了進(jìn)化方面的分析，結(jié)果表明這六個(gè)毒素在進(jìn)化樹(shù)上分別