miR--204--5p對結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的作用及機制的初步探討.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌(Colorectal cacner，CRC)給人類造成了嚴重的身心危害，帶來不容忽視的健康和經(jīng)濟問題。在美國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率均位居惡性腫瘤的第3位，隨著民眾健康意識的增強、診療技術(shù)及篩查手段的進步，其發(fā)病率與死亡率均有所下降[1]。但中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率及致死率常年位居惡性腫瘤的前5位，且發(fā)病年齡日趨年輕化，發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2-3]。中國城市癌癥篩查計劃項目組開展了城市地區(qū)常見癌癥（肺癌、乳腺

2、癌、大腸癌、食管癌、肝癌、胃癌）的綜合經(jīng)濟評價。通過多中心橫斷面調(diào)查(Multicenter Cross-sectional Survey)，統(tǒng)計分析了2012年至2014年在全國13個省市的37家三級醫(yī)院常見癌癥患者的醫(yī)療費用及其相關(guān)經(jīng)濟負擔，結(jié)果顯示大腸癌患者的經(jīng)濟負擔最重，人均支出約為6.9萬元，并且晚期結(jié)直腸癌患者的治療費用顯著高于早期患者[4]。盡管目前有多種方法診治結(jié)直腸癌，但因其早期癥狀不明顯，患者就診時間較晚，預后也較差

3、[5]。因此，對結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)分子的識別及其功能特點的研究不僅能為早期診斷結(jié)直腸癌提供依據(jù)，也能為其治療提供新的靶點與思路。Masuda等[6]報道指出microRNA（miRNA）在結(jié)直腸癌中異常表達，并與腫瘤的分化程度、臨床分期、治療反應及預后有關(guān)，提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，可作為早期診斷結(jié)直腸癌及反映病人預后的指標。miR-204-5p在多種惡性腫瘤組織中低表達，并能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)

4、轉(zhuǎn)化(Epithelia-Mesenchymal Transition，EMT)[7-10]，但其在結(jié)直腸癌的相關(guān)報道較少。本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)miR-204-5p能阻滯HT29細胞的細胞周期于G1期，從而抑制HT29細胞的增殖能力[11]。本實驗通過觀察miR-204-5p在結(jié)直腸癌與正常腸黏膜組織中的表達差異及其對細胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響，探討其發(fā)揮作用的可能機制，旨在為早期診治結(jié)直腸癌提供新的依據(jù)及靶點。
　　方法：

5、(1)收集本院23例配對新鮮結(jié)直腸癌組織及配對正常腸黏膜組織，熒光定量PCR檢測其中miR-204-5p的表達情況，并分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。(2)過表達miR-204-5p慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞株HT29及LoVo，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，熒光定量PCR檢測細胞中miR-204-5p的表達情況。(3)平板克隆形成實驗(Clone Formation Experiment)、劃痕愈合實驗(Scratch Healing Exper

6、iment)、Transwell侵襲實驗(Transwell Invasion Assay)檢測過表達miR-204-5p在體外實驗中對HT29、LoVo細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。(4)Western blot檢測過表達miR-204-5p后HT29和LoVo細胞中EMT相關(guān)分子E-cadherin及Vimentin蛋白表達情況。(5)利用TargetScan、miRDB及miRTarBase數(shù)據(jù)庫檢索miR-204-5p的靶基因

7、，在三個數(shù)據(jù)庫中得分均排名前50位的基因中取交集，預測得到的靶基因具有較高的可信度和準確性。Western blot檢測過表達miR-204-5p后HT29和LoVo細胞中靶基因的蛋白表達情況。
　　結(jié)果：(1)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與配對正常腸黏膜組織相比，miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中低表達（t=9.245，P＜0.001）。臨床病理分析結(jié)果顯示，miR-204-5p的表達水平與腫瘤大小(x2=7.078，P=0.

8、008)、TNM分期（x2=9.603，P=0.002）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(x2=7.340，P=0.007），而與患者年齡（x2=2.718，P=0.099）、性別（x2=2.718，P=0.099）、腫瘤分化程度(x2=1.343，P=0.511)、腫瘤部位（x2=0.434，P=0.510）及血清CEA水平（x2=0.910，P=0.340）無明顯相關(guān)性。(2)設(shè)置實驗分組，將商品化過表達miR-204-5p的慢病毒轉(zhuǎn)染至HT29和

9、LoVo細胞設(shè)立為實驗組即HT29-204-5P組和LoVo-204-5p組，將空載慢病毒轉(zhuǎn)染至HT29和LoVo細胞設(shè)立為對照組即HT29-NC組和LoVo-NC組。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HT29-204-5P組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組細胞均有綠色熒光表達。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HT29-204-5P組細胞中miR-204-5p表達水平高于HT29-NC組（t=-20.488，P＜0.001），

10、LoVo-204-5p組細胞中miR-204-5p表達水平高于LoVo-NC組（t=-59.078，P＜0.001）。(3)平板克隆實驗結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組及LoVo-NC組克隆形成率分別為（11±2.25）％、（14.67±3.33）％、（18.33±2.75）％及（27.67±2.93）％，HT29-204-5p組細胞克隆形成率顯著低于HT29-NC組（t=20.172，P＜

11、0.001），LoVo-204-5p組細胞克隆形成率顯著低于LoVo-NC組（t=5.077，P=0.001）。(4)細胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，劃痕24h后HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組劃痕愈合率分別為（16.03±2.35）％、（15.30±0.99）％、（25.41±4.36）％及（37.79±4.70）％，HT29-204-5p組劃痕愈合率顯著低于HT29-NC組（t=3.2

12、80，P=0.031），LoVo-204-5p組劃痕愈合率顯著低于LoVo-NC組（t=8.106，P=0.0012）。(5)Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，HT29-204-5p組、LoVo-204-5p組、HT29-NC組和LoVo-NC組細胞透過數(shù)分別為（15.07±3.23）個、（51.47±4.35）個、(28.93±4.02)個及（112.9±7.73）個，HT29-204-5p組細胞透過數(shù)目顯著少于HT29-NC組(t

13、=4.85，P=0.008)，LoVo-204-5p組細胞透過數(shù)目顯著少于LoVo-NC組（t=12.003，P＜0.001）。(6)Western blot檢測結(jié)果顯示，過表達miR-204-5p的HT29和LoVo細胞中E-cadherin表達上調(diào)(P＜0.001;P=0.016)，Vimentin表達下調(diào)(P=0.002;P=0.013)。(7)在TargetScan、miRDB及miRTarBase三個數(shù)據(jù)庫中檢索后初步得出MA