金雀異黃素對高糖環(huán)境足細胞自噬和炎癥損傷的干預機制研究.pdf

1、目的:隨著人口老齡化、飲食結構以及生活方式的改變，糖尿病發(fā)病率逐年升高，預計到2030年全球糖尿病患者將增加至3.66億。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，隨著糖尿病發(fā)病率的升高，糖尿病腎病患者也越來越多，目前已成為我國導致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔和精神壓力，嚴重影響著人們健康。進一步揭示糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展機制，探索防止或

2、延緩病變進展的有效措施是國內外腎臟病學界熱切關注的重要課題。
　　糖尿病腎病的病因復雜，涉及多種機制，包括糖代謝紊亂、血流動力學改變、氧化應激與炎癥損傷、細胞因子和遺傳背景等。糖尿病腎病的主要臨床表現為蛋白尿和進行性腎功能減退;其腎臟病理表現主要為腎小球系膜基質積聚、基底膜(GBM)增厚引起結節(jié)狀或彌漫性腎小球硬化以及腎小管-間質纖維化。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞損傷是蛋白尿的病理基礎，是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程

3、中的重要環(huán)節(jié)，但迄今其發(fā)生機制尚未明確。
　　自噬是溶酶體介導的細胞內蛋白和細胞器等物質的降解過程，是存在于真核生物細胞中的一種高度保守的保護性機制，對穩(wěn)定細胞內環(huán)境、維持細胞的存活具有重要意義。目前研究發(fā)現，足細胞具有高水平的基礎自噬活性，在高糖環(huán)境中，細胞信號通路發(fā)生改變，使細胞自噬功能受損，不能對各種應激產生保護性反應，且加重細胞器功能的紊亂和結構破壞，最終導致疾病的發(fā)生。足細胞自噬參與糖尿病腎病發(fā)生的機制研究已成為該領域的

4、熱點課題。
　　此外，長期微炎癥狀態(tài)是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，不同途徑激活的炎癥機制參與了糖尿病腎病的病理生理。Toll樣受體（TLRs）可在足細胞中表達，通過調控下游核因子κB(NF-κB)等信號分子的表達，激活炎癥反應。已知TLRs信號通路的兩條途徑的關鍵因子分別為:髓樣分化因子介導的88(MyD88)接頭蛋白，Toll樣受體(TIR)適配器誘導干擾素β結構域的（TRIF）銜接蛋白。目前關于TLRs/NF-κB信號通路在

5、糖尿病腎病發(fā)病機制中已有基礎研究，但具體涉及到兩個關鍵因子在糖尿病腎病中的具體表現少有描述。
　　金雀異黃素(GEN)是從大豆中提純的大豆異黃酮的主要組分。目前的基礎研究表明， GEN能緩解糖尿病小鼠腎臟氧化應激、炎癥和纖維化程度，發(fā)揮腎臟保護作用，但其作用機制并不明確。
　　本研究我們應用生理濃度的GEN對高糖環(huán)境下小鼠足細胞自噬的影響作用進行了觀察，同時也分析了GEN對TLRs/NF-κB信號傳導通路和其中的相關炎癥因子

6、的干預機制，旨在探討GEN在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的干預作用，為臨床治療提供實驗性理論研究。
　　方法:
　　1 GEN對高糖環(huán)境下足細胞自噬的影響
　　條件性永生化小鼠足細胞在33℃，γ-IFN存在的條件下培養(yǎng)傳代后，于37℃，無γ-IFN的條件下培養(yǎng)10-14天，使細胞分化成熟。免疫熒光化學檢測synaptopodin觀察足細胞成熟情況。未分化成熟的足細胞不表達synaptopodin，合格的細胞被用于實驗。①首先探

7、究高糖環(huán)境足細胞自噬的最佳時間。不同時間點應用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，應用western blot檢測微管相關蛋白3(microtubuleAssociated Protein Light Chain3，LC3Ⅱ)確定高糖環(huán)境足細胞自噬的最佳時間。②在GEN(20μM)和時間(6h)條件下，分別設置正常糖組（5.5mM，Normal glucose，NG）、甘露醇對照組(5.5 mM gl

8、ucose+24.5 mMmannitol,MC)、高糖組(30mM，High glucose，HG)、高糖+GEN組(30mMHG+0.05％DMSO+20μM genistein，G)、高糖+自噬抑制劑（氯喹）組(30mM HG+1μM chloroquine，CQ)和高糖+氯喹+GEN組(30 mM HG+1μMCQ+0.05％DMSO+20μM GEN，CG)，應用電鏡觀察自噬小體。③設置對照如上，應用免疫熒光化學，直觀分析LC

9、3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，p-mTOR)的表達。④應用western blot檢測LC3Ⅱ、p-mTOR的蛋白表達，應用western blot和real-time PCR方法檢測 nephrin的蛋白和基因水平，評估GEN對高糖環(huán)境足細胞自噬的影響。
　　2 GEN對高糖環(huán)境下足細胞TLRs/NF-κB通路的干預作用
　?、偈紫忍骄扛咛黔h(huán)境足細胞NF-κB p65

10、表達的最佳時間。不同時間點應用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h，應用western blot檢測NF-κB p65確定高糖環(huán)境足細胞NF-κB p65表達的最佳時間。②在GEN(20μM)和時間(48h)條件下，分別設置正常糖組(5.5 mM，Normal glucose，NG)、甘露醇對照組(5.5 mM glucose+24.5mM mannitol，MC)、高糖組（30 mM，High glu

11、cose，HG）和高糖+GEN組（30 mM HG+0.05％DMSO+20μM GEN，G），應用免疫熒光化學，直觀分析核因子κ B(nuclear factor kappa B，NF-κB p65)的表達。③設置組如上，應用westem blot，檢測MyD88、TRIF和NF-κB p65的蛋白表達，應用ELISA檢測單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)。④應用w

12、estem blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平，評估GEN對高糖環(huán)境足細胞內TLRs/NF-κB通路中的關鍵因子的干預作用，以及對足細胞的影響。
　　3 GEN對高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細胞自噬的影響
　?、賰?yōu)化轉染條件，找出化學合成的siRNA沉默MyD88/TRIF基因表達的最佳劑量。②將分化成熟的小鼠足細胞分為高糖組(HG)、高糖+對照siRNA組(HG+con.

13、siRNA，HC)、高糖+MyD88-siRNA組(HG+MyD88-siRNA,M)、高糖+MyD88-siRNA+GEN組(HG+ MyD88-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MG)組、高糖+TRIF-siRNA組（HG+TRIF-siRNA,T）、高糖+TRIF-siRNA+GEN組（HG+ TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,TG）、高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組(

14、HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA,MT)和高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA+GEN組(HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MTG)。經培養(yǎng)6h，應用免疫熒光化學，直觀分析LC3和p-mTOR表達。③設置對照如上，應用western blot檢測LC3Ⅱ和p-mTOR的蛋白表達，應用western blot和real-time PCR方法檢測

15、nephrin的蛋白和基因水平，評估基因敲減MyD88/TRIF后GEN對高糖環(huán)境足細胞自噬的影響。
　　4 GEN對高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細胞TLRs/NF-κB通路的干預作用
　　將分化成熟的小鼠足細胞分為高糖組(HG)、高糖+對照siRNA組(HG+con.siRNA，HC)、高糖+MyD88-siRNA組(HG+MyD88-siRNA，M)、高糖+ MyD88-siRNA+GEN組(HG+MyD88

16、-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,MG)組、高糖+TRIF-siRNA組(HG+ TRIF-siRNA，T)、高糖+TRIF-siRNA+GEN組(HG+TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組（HG+ MyD88-siRNA+ TRIF-siRNA，MT）和高糖+MyD88-siRNA+TRIF-siRNA組+GEN組(HG+MyD88-

17、siRNA+TRIF-siRNA+0.05％DMSO+20μM GEN，MTG)。①經培養(yǎng)48h，應用免疫熒光化學，直觀分析NF-κB p65的表達。②應用western blot，檢測MyD88、TRIF的蛋白表達，應用ELISA檢測MCP-1。③應用western blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平，評估GEN對高糖環(huán)境足細胞內TLRs/NF-κB通路中的關鍵因子的干預作用，以及對足細胞的影響

18、。
　　結果:
　　1 GEN對高糖環(huán)境下足細胞自噬的影響
　?、?3℃時的條件永生化小鼠足細胞，F-actin免疫熒光化學結果顯示，細胞形狀呈梭形或三角形，突起較少。Synaptopodin免疫熒光化學結果顯示，細胞胞漿中幾乎不表達。37℃經培養(yǎng)10-14天后的足細胞，F-actin免疫熒光化學結果顯示，細胞胞漿向四周展開，突起增多。Synaptopodin免疫熒光化學結果顯示，細胞胞漿中表達明顯增強。②高糖環(huán)境足細

19、胞自噬的時效關系實驗結果顯示:在高糖培養(yǎng)足細胞6h，LC3Ⅱ表達顯著(P＜0.01)。③電鏡觀察結果:在NG組和HG組均存在自噬小體，HG組中自噬小體較NG組偏多。④免疫熒光化學結果顯示:LC3在HG組、G組、CQ組和CG組表達均比較明顯。p-mTOR在HG組、G組表達偏弱，CQ組表達上調。⑤western blot結果顯示:LC3Ⅱ在各組均有表達，LC3Ⅱ在HG組、G組、CQ組和CG組表達更為明顯(P＜0.01)。p-mTOR在HG組

20、、G組表達下調(P＜0.05)，在CQ組表達水平偏高(P＜0.01)。⑥nephrin的western blot和Real-time PCR檢測結果顯示:nephrin在HG組表達下降(P＜0.01)，CQ組較CG組表達下調(P＜0.01)。
　　2 GEN對高糖環(huán)境下足細胞TLRs/NF-κB通路的干預作用
　?、俑咛黔h(huán)境足細胞NF-κB p65表達的時效關系實驗結果顯示:在高糖培養(yǎng)足細胞48h，NF-κB p65的核轉移

21、表達顯著(P＜0.05)。②免疫熒光化學結果顯示:NG和G組NF-κB p65主要在細胞胞漿中表達，HG組NF-κB p65主要在細胞胞核中表達。③western blot結果顯示:MyD88、TRIF在HG組較NG組表達上調(P＜0.01)，NF-κB p65的核蛋白表達在HG組較NG組顯著(P＜0.01)。④Nephrin的western blot和real-timePCR結果顯示:NG組和G組中表達顯著高于HG組。⑤ELISA檢測

22、結果顯示:MCP-1在HG組較NG組和G組表達上調(P＜0.01)。
　　3 GEN對高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細胞自噬的影響
　　①MyD88-siRNA和TRIF-siRNA驗證實驗結果:MyD88-siRNA和TRIF-siRNA能夠顯著敲減高糖環(huán)境足細胞MyD88/TRIF蛋白和mRNA的表達。證實在6孔板中以70 pmol/孔轉染足細胞敲減效果最好。②免疫熒光化學結果顯示，LC3在MT組較其他組在胞漿

23、表達較弱，MTG組較MT組表達上調。p-mTOR結果與其相反。③應用western blot檢測LC3Ⅱ、p-mTOR和nephrin的蛋白表達結果:與HG組相比，LC3Ⅱ在T組無明顯變化(P＞0.05)，在M組、MT組表達下降(P＜0.05);p-mTOR在M組、T組和MT組表達明顯升高(P＜0.01)。與M組相比，LC3Ⅱ和nephrin在MG組表達明顯上調(P＜0.01);p-mTOR在MG組表達明顯下降(P＜0.01)。與T組相

24、比，LC3Ⅱ和nephrin在TG組表達明顯上調;p-mTOR在TG組表達下降(P＜0.05)。與MT組相比，LC3Ⅱ和nephrin在MG組表達明顯上調(P＜0.01);p-mTOR在MG組表達明顯下降(P＜0.01)。④應用real-time PCR方法檢測nephrin的基因水平，與HG組相比，nephrin在M組和T組無明顯差異(P＞0.05)，M組水平偏高(P＜0.05)，MG組、TG組和MTG組表達明顯偏高(P＜0.01)。

25、
　　4 GEN對高糖環(huán)境下MyD88/TRIF基因敲減足細胞TLRs/NF-κB通路的干預作用
　?、倜庖邿晒饣瘜W結果:與HG和HC組相比， M組、T組和MT組中NF-κB p65在細胞核內表達明顯減弱，以MT組表達最弱。加用GEN組中NF-κB p65在細胞漿表達相對明顯。②ELISA檢測MCP-1結果:與HG和HC組相比，M組、T組和MT組表達下調，GEN治療組下調更為明顯(P＜0.01)。③應用western blo

26、t檢測NF-κB p65和nephrin結果示:與HG組相比，nucleus NF-κB p65在M組、T組和MT組表達下降(P＜0.01);nephrin在在M組、T組和MT組表達升高。與M組相比，nucleus NF-κB p65在MG組表達明顯下降(P＜0.01);nephrin在MG組表達明顯升高(P＜0.01)。與T組相比，nucleus NF-κB p65在TG組表達明顯下降(P＜0.01);nephrin在MG組表達明顯升

27、高(P＜0.01)。與MT組相比，nucleus NF-κB p65在MTG組中無明顯變化(P＞0.05);nephrin在MTG組表達明顯升高(P＜0.01)。④應用real-time PCR方法檢測nephrin結果:與HG組和HC組相比，敲減基因MyD88/TRIF和應用GEN都可使nephrin表達上調(P＜0.01)。⑤ELISA檢測結果顯示:與HG組相比，MCP-1在其他組均明顯下調。(P＜0.01)。
　　結論:

28、r>　　1在高糖刺激早期，GEN可通過促進細胞自噬發(fā)揮對足細胞的保護作用。
　　2在高糖刺激晚期，GEN具有足細胞抗炎保護作用，其作用機制可能是通過抑制TLRs/NF-κB信號通路減輕足細胞炎癥損傷所致。
　　3在高糖刺激早期，GEN可減輕TLRs/NF-κB信號通路阻斷后自噬的下降程度。
　　4 GEN干預TLRs/NF-κB信號通路從早期抑制MyD88開始，后期也對TRIF有抑制作用。而且在高糖刺激晚期，除了干預T