干細(xì)胞轉(zhuǎn)rAd-HCN4治療緩慢心律失常的研究.pdf

1、目的：⑴構(gòu)建攜帶人超極化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道4（HCN4）基因的重組腺病毒載體，獲得重組腺病毒rAd-HCN4，為進(jìn)一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平研究HCN4基因的功能奠定基礎(chǔ)。⑵通過(guò)以不同濃度5-氮胞苷體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀(guān)察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)、有無(wú)自主搏動(dòng)及 Westernblot檢測(cè) Connexin43結(jié)果，為構(gòu)建生物起搏器提供有效載體細(xì)胞。⑶通過(guò)刺激迷走神經(jīng)建立緩慢心律失常模型，對(duì)比rAd-HCN4-GFP誘導(dǎo)后干細(xì)胞及rA

2、d-GFP誘導(dǎo)后干細(xì)胞植入動(dòng)物后心率、心功能、肝腎功能、Connexin43含量的對(duì)比，從而獲得有效性及安全性的證據(jù)，為臨床提供一定的參考價(jià)值。
　　方法：①根據(jù)細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法使用AdEasy腺病毒包裝系統(tǒng)，將人HCN4基因克隆到腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pshuttle-CMV中，腺病毒穿梭質(zhì)粒pshuttle-CMV-HCN4線(xiàn)性化后與腺病毒載體pAdEasy發(fā)生同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒 pAdEasy-HCN4后，通過(guò)脂質(zhì)體

3、共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒rAd-HCN4-GFP，鑒定正確后進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定。②分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳至第三代后，加入5-氮胞苷誘導(dǎo)24小時(shí)，按照誘導(dǎo)濃度分為四組，對(duì)照組、5μmol/L組、10μmol/L組、15μmol/L組，培養(yǎng)4周，倒置顯微鏡觀(guān)察形態(tài)變化，有無(wú)自發(fā)搏動(dòng)，在第1、2、3、4周行Westernblot檢測(cè)Connexin43表達(dá)。分別將獲得的rAd-HCN4-GFP、rAd-GFP轉(zhuǎn)染誘

4、導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。③隨機(jī)將60只大鼠分為兩組，分別將轉(zhuǎn)染后的誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接注入大鼠的左心室肌內(nèi)，飼養(yǎng)2周后記錄體表心電圖、心功能、肝腎功。刺激迷走神經(jīng)制作緩慢性心律失常模型，分別記錄2組的心電圖，處死動(dòng)物后觀(guān)察熒光，提取心肌組織行western blot測(cè)定對(duì)比Connexin43表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴過(guò)酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定，結(jié)果證明重組腺病毒載體pAdEasy-HCN4構(gòu)建成功；重組腺病毒rAd-HCN4進(jìn)行P

5、CR鑒定可見(jiàn)到陽(yáng)性擴(kuò)增條帶，測(cè)定重組腺病毒rAd-HCN4滴度高達(dá)1×109 Tu/ml。⑵5-氮胞苷濃度10μmol/L組為適宜誘導(dǎo)濃度，5μmol/L組濃度不能達(dá)到誘導(dǎo)分化作用，15μmol/L組細(xì)胞死亡率高。未觀(guān)察到心肌樣細(xì)胞的單個(gè)搏動(dòng)或多個(gè)同步搏動(dòng)。通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察熒光表達(dá)，成功轉(zhuǎn)染rAd-HCN4-GFP和rAd-GFP的誘導(dǎo)后大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)綠色熒光蛋白。⑶rAd-GFP組基礎(chǔ)心率為310.56±12.0次/分，

6、rAd-HCN4-GFP組基礎(chǔ)心率為407±3.56次/分，兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。rAd-GFP組刺激迷走神經(jīng)后心率為140.04±3.14次/分，rAd-HCN4-GFP組刺激迷走神經(jīng)后心率為239.6±12.00次/分，兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。rAd-GFP組刺激迷走神經(jīng)后室性心律失常發(fā)生率為30％（9/30），rAd-HCN4-GFP組刺激迷走神經(jīng)后室性心律失常發(fā)生率為96.67%（29/30），

7、兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。兩組之間EF值、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。rAd-HCN4-GFP組心室 connextin43表達(dá)為3.24±0.10，rAd-GFP組心室connextin43表達(dá)為0.56±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：①構(gòu)建了攜帶HCN4基因的重組腺病毒載體，并成功包裝出重組腺病毒 rAd-HCN4-GFR。探索HCN4基因作為基因

8、治療靶基因的價(jià)值，為竇房結(jié)功能障礙和重度房室傳導(dǎo)阻滯的基因治療提供候選基因，并為臨床前研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。②經(jīng)過(guò)5-氮胞苷誘導(dǎo)后的心肌樣細(xì)胞無(wú)論在形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性上均與心肌細(xì)胞相似，但由于5-氮胞苷為細(xì)胞毒性藥物，其應(yīng)用于臨床的安全性有待商榷。③經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染干細(xì)胞懸液注入心肌后證實(shí)HCN4在心室肌內(nèi)的有效表達(dá)，心室肌HCN4的有效表達(dá)能增高刺激迷走神經(jīng)后室性異位搏動(dòng)的發(fā)生，且能夠與周?chē)氖壹〖?xì)胞建立有效的縫隙連接，是維持電生理搏動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)