HEPIS基因功能的初步研究.pdf

1、目的：通過對人類睪丸組織高表達的四百多個未知功能基因進行大規(guī)模基于雙熒光素酶活性檢測的信號通路篩選，發(fā)現(xiàn)了一批激活或抑制信號通路的陽性基因，能夠顯著上調(diào)或下調(diào)內(nèi)參螢火蟲熒光素酶活性。從中選擇顯著抑制 NF-κB信號通路的基因HEPIS（Human embryo lung cellular protein interacting with SARS-CoV nsp-10，HEPIS）進行功能研究。生物信息學分析HEPIS基因，初步了解其基

2、本理化性質(zhì)、對應蛋白質(zhì)的結構并預測其功能；通過半定量-PCR研究HEPIS在不同組織的表達譜；預測和驗證 HEPIS蛋白的亞細胞定位；分別構建高效 HEPIS真核表達質(zhì)粒和siRNA沉默子，體外瞬時轉染腎細胞系293T和腎癌細胞系 A498，通過細胞形態(tài)及功能的變化探討 HEPIS基因抑制細胞增殖的機制，為開發(fā)有重要生理活性及臨床應用前景的新功能基因奠定基礎。
　　方法：1、目的基因的篩選：分析海腎/螢火蟲熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)對

3、 NF-κB、CRE、Wnt和HRE四條通路大規(guī)模篩選的結果，選擇HEPIS為本次研究的目的基因。2、生物信息學分析：通過各種分析軟件和生物信息學預測網(wǎng)站預測分析HEPIS基因的核酸及 HEPIS蛋白質(zhì)的序列組成、理化性質(zhì)、定位、信號肽、跨膜結構域、物種同源性及二級結構等。3、表達譜分析：利用半定量RT-PCR技術檢測HEPIS基因的在多個細胞系中的表達譜，選取目的基因對細胞增殖影響研究的適合細胞系。4、真核表達質(zhì)粒的克隆構建：利用分子

4、克隆技術將目的基因 HEPIS的CDS區(qū)插入到pCMVSPORT6、pEGFPC3、pEGFPN1的真核表達載體上。5、亞細胞定位：將 HEPIS-pEGFPN1和HEPIS-pEGFPC3分別轉染入293T細胞，熒光顯微鏡下觀察融合的綠色熒光蛋白在細胞內(nèi)位置，推斷蛋白定位。6、使用引物設計軟件針對HEPIS的CDS區(qū)設計、合成并擴增針對目的基因的siRNA片段，使之形成Hairpin siRNA結構，有效沉默目的基因，并且通過實驗驗證

5、沉默與過表達的效率。7、功能實驗：通過對細胞形態(tài)的觀察、克隆形成、劃痕實驗、CCK8試劑盒檢測等來驗證過表達和沉默HEPIS對腎細胞系293T以及腎癌細胞系A498增殖的影響。8、HEPIS抑制細胞增殖的機理：首先通過轉染使 HEK293T細胞過表達或沉默HEPIS，然后利用血清饑餓培養(yǎng)使細胞周期同步化，最后通過流式細胞術檢測細胞周期，明確HEPIS影響細胞周期的途徑。
　　結果：1、篩選結果顯示 HEPIS顯著下調(diào) NF-κB的

6、活性。2、生物信息學分析顯示：HEPIS全長666bp，CDS區(qū)444bp，可編碼出一個147個氨基酸蛋白質(zhì)，無跨膜結構，無信號肽，定位在細胞核，與其他物種同源性較低，是人類進化較特異的基因。3 RT-PCR實驗表明 HEPIS廣泛表達于人類細胞系中。4、將 HEPIS-pEGFPN1和HEPIS-pEGFPC3分別轉染入293T細胞，熒光顯微鏡下觀察融合的綠色熒光蛋白在細胞內(nèi)位置，結果表明其定位于胞質(zhì)。5、以空載 pCMVSPORT6

7、載體質(zhì)粒為對照，分別轉染過表達 HEPIS基因的質(zhì)粒和轉染干擾 HEPIS基因表達的siRNA沉默子，通過在293T細胞系中24小時后觀察細胞形態(tài)和在A498細胞系中15天克隆形成計數(shù)發(fā)現(xiàn) HEPIS有抑制細胞增殖作用。6、在腎細胞系293T和腎癌細胞系 A498中，應用 CCK8試劑盒連續(xù)檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)過表達 HEPIS組細胞增殖顯著下降，沉默 HEPIS組細胞增殖顯著增強。7、轉染24小時后，F(xiàn)CM檢測細胞周期，分析得知過表達