傷寒沙門菌非編碼RNA AsrC的驗證與特性研究.pdf

1、目的:
　　 非編碼RNA(non-codingRNA，ncRNA)已經(jīng)成為核酸和蛋白質(zhì)之外參與基因表達調(diào)控的另一類重要因子。本課題組通過對傷寒沙門菌（SalmonellaentericaserovarTyphi，S.Typhi）RNA序列分析和生物信息學預測，發(fā)現(xiàn)了包括AsrC在內(nèi)的一些ncRNAs。本研究旨在對S.TyphincRNAAsrC進一步鑒定，并研究其特性，以便對AsrC參與的基因表達調(diào)控進行深入研究。
　　

2、 方法:
　　 1.AsrC的鑒定:利用NorthernBlot和qRT-PCR對AsrC進行存在性、完整性驗證，并觀察其生長時相表達特性。
　　 2.AsrC的分子全長鑒定:分別利用5′和3′RACE實驗尋找AsrC的轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄終止點，以確定AsrC的分子全長。
　　 3.AsrC在應激條件下的表達量分析:利用NorthernBlot和qRT-PCR對傷寒沙門菌在不同生長時期，酸、氧及高滲環(huán)境應激后As

3、rC的水平進行分析。
　　 4.基因缺陷變異株的制備:利用λ-Red系統(tǒng)制備傷寒沙門菌asrC基因啟動子缺陷變異株。
　　 5.基因缺陷回補株的制備:利用重組質(zhì)粒pBAD/gⅢ將lepA基因和pBAD/gⅢ空質(zhì)粒分別導入asrC基因啟動子缺陷變異株，構(gòu)建lepA基因的缺陷回補株和lepA缺陷空質(zhì)粒對照株。
　　 6.asrC基因啟動子缺失的定量分析:qRT-PCR分析S.Typhi野生株、asrC基因啟動子缺陷株

4、中AsrC的水平。
　　 7.生長曲線的測定:制作生長曲線，觀察S.Typhi野生株、asrC基因啟動子缺陷株、lepA基因缺陷回補株及空質(zhì)粒對照株在等滲、氧應激、酸應激和高滲應激時的生長狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)NorthernBlot和qRT-PCR分析，確定AsrC存在表達，并發(fā)現(xiàn)其在對數(shù)生長后期（OD6000.8）時AsrC的表達量最高。
　　 2.經(jīng)過5'和3'RACE實驗鑒定AsrC的

5、分子全長信息，并確定其分子全長為893bp，與lepA基因部分重疊。
　　 3.NorthernBlot和qRT-PCR結(jié)果表明，S.TyphiAsrC在酸、氧及高滲應激時的表達量均下降。
　　 4.利用λ-Red系統(tǒng)成功制備S.Typhi包含asrC基因啟動子區(qū)域500bp的缺陷變異株。
　　 5.PCR及序列分析結(jié)果表明，成功構(gòu)建pBAD-lepA陽性重組質(zhì)粒，并成功將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒pBAD/gⅢ分別導入a

6、srC基因啟動子基因缺失變異株中，成功制備lepA基因缺陷回補株和空質(zhì)粒對照株。
　　 6.qRT-PCR結(jié)果顯示，與S.Typhi野生株相比，asrC基因啟動子缺失變異株中AsrC的水平顯著降低。
　　 7.生長曲線分析結(jié)果顯示，在氧應激時asrC基因啟動子缺失變異株生長明顯比S.Typhi野生株慢(P＜0.05)，而lepA基因回補株及空質(zhì)粒株的生長速度與野生株相似;在等滲條件、酸應激和高滲應激時，四種菌株的生長狀況