酪氨酸酶異源表達體系構建及活性分析.pdf

1、酪氨酸酶是一類結構復雜的氧化還原酶類，能夠催化酪氨酸生成黑色素，普遍存在于微生物、植物以及哺乳動物中。酪氨酸酶具有多種特殊的催化活性，近年來在食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領域應用廣泛，引起了國內外的普遍關注。但由于從生物體內直接分離純化酪氨酸酶工藝非常復雜，產(chǎn)量十分有限，導致目前商品化的酪氨酸酶價格昂貴且需國外進口，嚴重制約了酪氨酸酶的生產(chǎn)應用。因而利用分子重組技術獲得高效表達酪氨酸酶的工程菌成為當下研究的熱點。 釀酒酵母(Saccharomyc

2、es cerevisiae）作為真核模式生物，以其生長繁殖快，蛋白質含量高和安全無毒等特點，目前已成為異源表達的首選菌種。
　　本文借助化學合成和反轉錄方法，分別獲得了根瘤菌（Rhizobium etli），麥芽假單胞菌（Pseudomonas maltophila）以及雙胞蘑菇（Agaricus bisporus）的酪氨酸酶相關基因，并以釀酒酵母S288C衍生體BY系列菌株作為出發(fā)菌株，構建了酪氨酸酶的異源表達體系。通過檢測酪氨

3、酸酶的異源表達情況，成功篩選到一株能夠正確表達雙胞蘑菇酪氨酸酶的釀酒酵母菌株 SC-PPO2A，為酪氨酸酶的商業(yè)化生產(chǎn)應用提供了可能。隨后通過在離體條件下對酪氨酸酶活性的分析測定，探索了各種催化條件對酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶體外催化最適 pH為7.0-8.0，最適溫度45℃，對底物酪氨酸和L-DOPA的飽和濃度分別為2mM和15mM。繼而通過對酪氨酸酶的胞內活性進行分析發(fā)現(xiàn)，將穩(wěn)定期的酵母培養(yǎng)體系pH調至9.0，同時補加2.5mg/m