瑪咖中特征活性成分制備與抗疲勞作用研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏和壓力不斷變大，人們可能伴隨著不同程度的疲勞癥狀，長期處于精神和體力疲勞狀態(tài)，危害人體免疫功能等，進而導致各類疾病的發(fā)生發(fā)展。隨著人們對以疲勞為代表的亞健康狀態(tài)關注度不斷提升，從天然來源動植物和微生物中探索安全有效的抗疲勞活性成分和產品，已成為目前科學研究和產業(yè)開發(fā)的熱點。
　　瑪咖屬于十字花科類草本植物（溫、甘、平，歸肺、腎經），含有豐富的營養(yǎng)成分和次級代謝產物，已知的生物活性包括：提高性功能、緩解體力疲勞和作為

2、脂肪酸水解酶抑制劑等，然而很多生物功效的物質基礎還不清楚?，斂０奉悊误w化合物作為瑪咖中特有的次級代謝產物，被廣泛認為是瑪咖生物活性的功能成分之一，然而受限于瑪咖中酰胺類化合物含量低、種類多，且單體間結構和性質相似等因素，瑪咖酰胺單體獲取困難。因此，目前與瑪咖相關的研究集中于瑪咖酰胺單體化合物的發(fā)現(xiàn)和定性定量分析、瑪咖及其提取物的藥理藥效研究，產品開發(fā)也大都集中于瑪咖粗加工和粗提物應用領域。
　　為了更深入研究瑪咖的生物活性物質基

3、礎和功效，我們認為，瑪咖酰胺的更高效提取和規(guī)模化制備是瑪咖深層次研究和開發(fā)的必經之路。本課題擬從天然瑪咖酰胺提取和化學合成的角度分別出發(fā)，開發(fā)瑪咖酰胺單體化合物的制備和合成工藝，為瑪咖中特征成分的藥理藥效評價提供物質基礎；考察所制備瑪咖酰胺的抗疲勞作用，以期為瑪咖產品深層次開發(fā)提供新思路和參考。
　　目的：設計從瑪咖中提取瑪咖酰胺類單體化合物最優(yōu)的實驗工藝，并探索富集瑪咖酰胺新方法；設計瑪咖中主要瑪咖酰胺類單體的合成和純化工藝，并

4、探索大量合成高純度瑪咖酰胺的新思路；體內評價N-芐基十六碳酰胺對小鼠體力疲勞作用效果及其相關指標變化。
　　方法：采用超聲提取瑪咖粉的方法富集瑪咖酰胺，首次提出了酸堿反應減少主要雜質（脂肪酸類），并通過正交實驗，在料液比、超聲時間、溶劑類型、氫氧化鈉添加量和反應時間等方面，優(yōu)化提取工藝。進一步探索瑪咖中主要瑪咖酰胺的合成工藝，結合前人酰胺鍵合成的經驗，采用最傳統(tǒng)酰胺鍵合成方法即碳二亞胺縮合法，利用不同的脂肪酸包括亞麻酸，亞油酸和硬

5、脂酸等，由碳二亞胺類縮合劑活化脂肪酸中的羧基，再和芐胺或間甲氧基芐胺結合，生成瑪咖酰胺類化合物。反應過程中加入酰胺鍵的催化劑和縛酸劑，加快合成反應的速率；對合成產物采用酸堿反應、重結晶和硅膠柱等純化方法，得到大量高純度的瑪咖酰胺，通過一系列的檢測方法包括1H和13C NMR，MS-ESI，IR和HPLC-DAD，證明合成的單體就是瑪咖酰胺類化合物。為了進一步確定瑪咖酰胺是瑪咖藥效的物質基礎，選擇N-芐基十六碳酰胺單體屬于瑪咖酰胺類化合物

6、，評價其緩解小鼠體力疲勞效果，并在四個不同的時間點觀察小鼠體重和負重游泳時間的變化；體內指標采用試劑盒法檢測小鼠肝糖元、尿素氮、乳酸脫氫酶、血胺和血乳酸含量的變化，簡單探討瑪咖酰胺緩解體力疲勞的功效。
　　結果：
　　1.瑪咖中主要酰胺類化合物的提取工藝優(yōu)化研究
　　通過正交實驗，優(yōu)化實驗工藝，得出在最優(yōu)條件如下：以乙醚為提取溶劑，料液比1:30（g/mL），超聲時間30min；酸堿反應的最佳條件為：氫氧化鈉添加量1:

7、5（g/mL），反應溫度50℃和酸堿反應時間50min。提取物UV色譜圖顯示，其中主要含有五種瑪咖酰胺單體化合物，這里將五種酰胺類單體總含量計算成瑪咖中瑪咖酰胺類化合物的總含量，在這樣的條件下，提取物中的瑪咖酰胺含量為20.79％，相對于DBS53/001—2015《食品安全地方標準瑪咖干制品》中的提取方法，它的相對含量上升了73.9%。
　　2.合成瑪咖中主要的五種瑪咖酰胺類單體化合物
　　利用1H和13C NMR，MS-

8、ESI，IR和HPLC-DAD等方法檢測最終產物，結果表明：合成的單體化合物就是瑪咖中五種主要的單體化合物即間甲氧基-芐基-亞麻酰胺，芐基-亞麻酰胺，間甲氧基-芐基-亞油酰胺，芐基-亞油酰胺和芐基-十六烷酰胺，且它們的大概純度分別為97.63%,95.71%,96.21%,95.13%和95.92%。
　　3.評價N-芐基十六碳酰胺緩解小鼠體力疲勞能力
　　C57小鼠每天被灌胃N-芐基十六碳酰胺單體，持續(xù)30天，在不同的時間

9、點檢測小鼠的體重和負重游泳時間變化，最后嚴格按照不同試劑盒中標準方法，檢測小鼠血清中指標和肝臟中糖原含量，結果表明：實驗組小鼠（灌胃瑪咖酰胺類單體）與空白組相比，小鼠體重變化沒有顯著性差異，而實驗組中小鼠的負重游泳時間和肝糖原含量，都顯著高于空白組；空白組小鼠其他血清中的指標如血乳酸、乳酸脫氫酶、血胺和尿素氮含量等，均顯著性高于實驗組。結果表明，N-芐基十六碳酰胺單體作為瑪咖中特有的次級代謝產物，是緩解小鼠體力疲勞的功效成分之一。

10、>　　結論：瑪咖中酰胺類單體化合物是極性最弱的酰胺類生物堿之一，利用其特殊的理化性質，采用乙醚作為瑪咖酰胺最佳的超聲提取溶劑，極大的富集瑪咖中五種主要的單體化合物，同時采用酸堿反應方法，顯著的減少脂肪酸類等雜質，純化瑪咖酰胺類單體；在探索提取工藝過程中，提出了碳二亞胺類縮合法，是瑪咖酰胺合成的有效途徑，既通過酸堿反應和重結晶等方法純化瑪咖酰胺單體化合物，得到大量高純度的瑪咖酰胺類單體。藥理實驗表明，其中 N-芐基-十六碳酰胺作為結構最簡