三種環(huán)境因子對三解帆蚌外套膜Ca2+代謝和ALP基因表達的影響.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是我國最主要的育珠母蚌，所產珍珠色澤鮮艷、細膩光滑，是淡水珍珠生產用的首選蚌種。目前，珍珠產量不斷增長，但同時養(yǎng)殖淡水珍珠的質量卻日益退化，而其中很重要的原因是目前對珍珠生長的分子遺傳機制的認識不足，特別是對Ca2+代謝調控下的珍珠貝和珍珠生長的分子基礎和機理的研究目前尚未闡明。開展珍珠生長的分子機制研究不僅可以促進珍珠科學理論研究的深入發(fā)展，還可以為其產業(yè)發(fā)展中珍珠培育技術的創(chuàng)新和發(fā)展提供

2、指導，因此是當前育珠業(yè)亟待研究的課題之一。
　　 鑒于以上背景，本論文主要包括以下兩部分研究內容：
　　 一、三種不同環(huán)境因子對三角帆蚌鈣代謝影響的研究
　　 本研究采用非損傷微測技術(Non-invasivemicro-testtechnology，NMT)和激光共聚焦顯微鏡(Confocallaserscanningmicroscope，CLSM)技術在細胞水平上對三角帆蚌外套膜細胞外Ca2+的運動方向與速率

3、、細胞內Ca2+囤積進行測定。試驗將3只育珠蚌的外套膜培養(yǎng)組織或細胞分成3個組(3個重復/組)，每組培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的Ca2+(對照組、0.5、1.25、3mmol/L)、不同濃度的VD3(對照組、50、100、500IU/L)，及置于不同溫度下(20、26、30℃)培養(yǎng)。
　　 研究結果表明，添加Ca2+時，細胞外Ca2+流動方向是從外排逐步變?yōu)閮攘鳎㈦S濃度增大，Ca2+流動速度增大，細胞內部的熒光信號增強，其中添加

4、3mmol/L組Ca2+內流速度最大，細胞內部信號最強，相比其余組差異顯著(P<0.05)；添加VD3時，Ca2+的流動方向也從外排逐步轉變成向外套膜細胞方向內流，并且隨著濃度增加，Ca2+流動速度增大，細胞內部的Ca2+熒光信號增大，其中500IU/L組相比對照組差異顯著(P<0.05)；溫度對三角帆蚌外套膜細胞Ca2+的代謝也有重要作用，隨著溫度的升高，Ca2+運動方向的變化從外排到內流再外排(P<0.05)，細胞內部Ca2+信號也

5、不斷增強，其中在溫度26℃的條件下，Ca2+內流速度最大，細胞內部信號最強(P<0.05)。
　　 二、三種不同環(huán)境因子對三角帆蚌堿性磷酸酶(ALP)基因表達、酶活性性的影響及其與鈣代謝水平的相關分析
　　 堿性磷酸酶(ALP)與珍珠質的形成關系密切，在鈣轉運和珍珠生物礦化中起著重要的作用，因此本試驗探討了ALP對三角帆蚌體內鈣代謝的影響。試驗通過巢式及3’-RACEPCR技術獲取ALP基因3’端序列，并進行生物信息學分

6、析，利用熒光Real-timeQ-PCR，運用雙標準曲線法分析ALPmRNA在外套膜外表皮、腮、內臟團、斧足、珍珠囊中表達水平的差異，以及在不同Ca2+、VD3、溫度培養(yǎng)條件下的ALP表達差異和酶活性的差異。
　　 試驗得到ALP基因3’端序列長度為924bp堿基，該基因在三角帆蚌珍珠囊內表達量最高，與其他組織比較，有顯著差異(P<0.05)。三種培養(yǎng)條件下的外套膜外表皮組織中ALP基因表達以及酶活性差異綜合分析表明，高濃度的C