β-欖香烯抑制HepG2細胞侵襲及遷移的作用機制研究.pdf

1、肝癌（HCC）是全球最常見的，死亡率最高的惡性腫瘤之一，每年有100萬例新確診的病例。目前，肝癌手術切除仍然是治療肝癌最有效的方法，但是僅對早期確診的患者有效。術后腫瘤復發(fā)與轉移是患者不能長期生存的主要原因，而肝癌的復發(fā)及轉移又是一個十分復雜的過程，因此尋求有效的治療肝癌轉移的方法來提高患者的生存率及改善患者的生存質量變得十分重要。
　　腫瘤的轉移是一個多步驟多環(huán)節(jié)的復雜過程，蛋白水解酶對于細胞外基質的降解在這個過程中起著至關重要

2、的作用。MMPs是一類主要的蛋白水解酶，與降解細胞外基質以及惡性腫瘤的轉移相關。MMP-9是MMPs家族中重要的一員，在多種腫瘤中，它均可以促進腫瘤細胞的侵襲及轉移。NF-κB是核轉錄因子，活化的NF-κB入核與DNA結合，引起多種與腫瘤生長和進展有關的分子的活化與表達。研究發(fā)現在腫瘤中NF-κB活化可以促進MMP-9的表達及分泌，抑制NF-κB的活化能夠下調MMP-9的表達及分泌，從而抑制腫瘤的侵襲及轉移。
　　β-欖香烯是從姜

3、科姜黃屬植物溫莪術中提取的倍半萜烯類化合物，它是我國自行研發(fā)的國家二類抗腫瘤新藥，具有抗瘤譜廣泛，療效確切，毒副作用輕微等突出優(yōu)點。有研究表明β-欖香烯可以通過誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期、干預腫瘤細胞分化，抗氧化等作用機制來抑制肝癌生長，但是對于其抑制肝癌轉移的相關研究較少。我們的研究目的在于探討β-欖香烯是否可以抑制肝癌HepG2細胞的侵襲及遷移以及它是否可以通過抑制NF-κB介導的MMP-9的分泌及表達來發(fā)揮其抑制肝癌轉移的作用，為

4、尋找有效的抗肝癌轉移藥物和治療策略提供實驗依據。
　　目的：
　　1.探討β-欖香烯對HepG2細胞增殖活性的影響，篩選出低細胞毒性的β-欖香烯用于接下來的實驗，以排除增殖抑制對細胞黏附、遷移以及侵襲實驗的影響。
　　2.探討β-欖香烯是否通過抑制肝癌HepG2細胞NF-κB的核轉位來下調MMP-9的酶活性及蛋白表達，發(fā)揮其抑制肝癌細胞轉移的能力。
　　方法：
　　1. MTT法觀察β-欖香烯對肝癌細胞增殖

5、活性的影響。
　　取對數生長期的肝癌HepG2細胞，分別給予每組細胞0、12.5、25、50、100、200、400μg/mlβ-欖香烯，培養(yǎng)24h后，MTT法檢測各組細胞的細胞活性。
　　2.β-欖香烯對HepG2細胞黏附、侵襲及遷移能力的影響。
　　以0、12.5、25μg/mlβ-欖香烯作用于HepG2細胞，通過細胞-基質黏附實驗觀察β-欖香烯對HepG2細胞與細胞外基質黏附能力的影響；劃痕實驗定性研究β-欖香烯

6、對肝癌細胞遷移能力的影響；在此基礎之上，利用Transwell侵襲和遷移實驗，定量觀察β-欖香烯對肝癌細胞侵襲、遷移能力的影響。
　　3.β-欖香烯抑制肝癌轉移的作用機制
　　通過明膠酶譜法及Western Blot觀察不同濃度β-欖香烯對于MMP-9酶活性及蛋白表達的影響；通過免疫熒光實驗及Western Blot觀察不同濃度β-欖香烯對于NF-κB核轉位的影響；通過使用NF-κB核轉位特異性抑制劑DHMEQ觀察是否可以通

7、過抑制NF-κB的核轉位來抑制MMP-9的分泌及表達，從而進一步闡明β-欖香烯抑制肝癌細胞轉移的作用機制。
　　結果：
　　1. MTT法顯示：
　　高濃度的β-欖香烯(≥50μg/ml）可以抑制肝癌HepG2細胞的增殖，在分別給予各組細胞50、100、200、400μg/mlβ-欖香烯后，細胞的存活率分別是（88.93±3.05％， P<0.05），（68.06±2.79%，P<0.05），（40.77±0.73%，

8、P<0.05），（36.97±0.81%，P<0.05），其存活率呈現的是一個逐漸遞減的趨勢。低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）不能明顯抑制肝癌HepG2細胞的增殖，所以取β-欖香烯濃度為12.5μg/ml，25μg/ml用于接下來的實驗以排除增殖抑制對于實驗的影響。
　　2.β-欖香烯對HepG2細胞黏附、侵襲及遷移能力的實驗研究表明：
　　細胞-基質黏附實驗結果顯示：低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）可以抑制細胞

9、與基質之間的黏附能力，在分別給予各實驗組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對照組相比，HepG2細胞的黏附率分別是（71.02±2.92%，P<0.05），（47.32±0.91%， P<0.05），各組細胞的黏附率呈現出逐漸遞減的趨勢。劃痕實驗結果顯示：低濃度的β-欖香烯可以抑制HepG2細胞的遷移能力，在給予各組細胞0、12.5、25μg/ml的β-欖香烯后，劃痕的愈合率分別為（65.82±2.12%，P<0.

10、05），（40.24±0.91%，P<0.05），（31.22±1.72%，P<0.05），各組細胞的遷移率呈現出的是一個遞減的趨勢。Transwell小室遷移實驗表明：低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）可以抑制細胞的遷移能力，在分別給予各實驗組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對照組相比，HepG2細胞的遷移率分別為（53.57±2.31%，P<0.05），（17.86±1.81%，P<0.05），其遷移率呈

11、現出逐漸遞減的趨勢。Transwell侵襲實驗表明：低濃度的β-欖香烯可以抑制細胞的侵襲能力，在分別給予各實驗組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對照組相比，HepG2細胞的侵襲率分別為（50.03±3.51%，P<0.05），（31.25±2.37%，P<0.05），各組細胞的侵襲率呈現出逐漸遞減的趨勢。
　　3.β-欖香烯對肝癌轉移相關因子表達影響的實驗表明：
　　（1）明膠酶譜法表明：β-欖香烯可

12、以抑制HepG2細胞MMP-9的酶活性，在分別給予各組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，MMP-9的酶活性分別是對照組的0.31倍（P<0.05），0.08倍（P<0.05）。免疫熒光實驗表明：β-欖香烯可以抑制NF-κB的核轉位，與對照組相比，在給予各實驗組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后， NF-κB的核轉位能力呈現的是遞減的趨勢。Western Blot表明，β-欖香烯可以降低細胞的MMP-

13、9及細胞核內的NF-κB蛋白的表達，同時還可以增加細胞質內NF-κB蛋白的表達。在分別給予各組細胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，MMP-9的蛋白的表達分別是空白對照組的0.79倍（P<0.05），0.53倍（P<0.05）；細胞核內NF-κB蛋白的表達分別是空白對照組的0.65倍（P<0.05），0.53倍（P<0.05）；細胞質內NF-κB蛋白的表達分別是空白對照組的2.20倍（P<0.05），6.12倍（P<0.

14、05）。
　?。?）在給予HepG2細胞20μg/ml的NF-κB核轉位特異性抑制劑DHMEQ后，通過明膠酶譜法及Western Blot免疫印跡實驗發(fā)現，與空白對照組相比，MMP-9的酶活性及蛋白表達均明顯下降（P<0.05）
　　結論：
　　1.高濃度的β-欖香烯（≥50μg/ml）具有抑制HepG2細胞增殖的能力。
　　2.低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）具有抑制HepG2細胞黏附，侵襲及遷移的能力。