茶枝柑及近緣種的分子鑒別研究.pdf

1、目的:
　　茶枝柑為蕓香科(Rutacae)柑橘屬(Citrus)植物，其外層果皮制干，陳化3年以上即為廣陳皮，具有理氣健脾、和胃止嘔、燥濕化痰、疏肝利膽、解結(jié)化癰等多種功效。其果肉富含糖類、有機(jī)酸、天然維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)可作為陳皮茶、添加劑和香料等，具有很高的食用價(jià)值。作為廣東道地藥材的廣陳皮，是臨床用藥的首選藥材，開(kāi)發(fā)前景廣闊。但由于廣陳皮與一般陳皮在市場(chǎng)上價(jià)格差異極大，因此市場(chǎng)上多有一般陳皮冒充廣陳皮的現(xiàn)象。陳皮與廣陳皮

2、的區(qū)分主要以產(chǎn)地來(lái)分的，廣陳皮主產(chǎn)于廣東新會(huì)、四會(huì)等地，陳皮則主產(chǎn)于福建、湖南、江西、重慶、湖北、四川等地。而現(xiàn)有的性狀、顯微等鑒別方法以及檢測(cè)陳皮指標(biāo)性成分等，不適于快速準(zhǔn)確鑒別廣陳皮與一般陳皮。因此為確保陳皮藥材質(zhì)量穩(wěn)定可控和臨床用藥安全有效，建立快速準(zhǔn)確鑒別茶枝柑與其他柑橘品種的方法是亟待解決的問(wèn)題。
　　方法:
　　本研究采用了ISSR分子標(biāo)記對(duì)茶枝柑及近緣種共38份材料進(jìn)行區(qū)分;對(duì)比SCoT分子標(biāo)記和ISSR分子標(biāo)

3、記的鑒別優(yōu)勢(shì);同時(shí)探索SCoT結(jié)合克隆測(cè)序?qū)ξ锓N鑒定的可行性;尋找適合茶枝柑及近緣種鑒別的通用條形碼;以及嘗試在分子角度上區(qū)分茶枝柑的駁枝和芽枝;最后對(duì)茶枝柑果皮的DNA提取方法優(yōu)化，嘗試對(duì)比不同貯存年限茶枝柑果皮的DNA含量變化，將茶枝柑果皮與葉的基因序列進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，以期為今后市場(chǎng)上流通的各類陳皮進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。
　　結(jié)果:
　　1.采用L16正交設(shè)計(jì)法對(duì)茶枝柑的ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終優(yōu)化結(jié)果為1×PCR buff

4、er,1.5mmol/L Mg2+,0.2mmol/L dNTPs,0.3μ mol/L primer,0.5U Taq酶，50ng模板DNA。通過(guò)篩選退火溫度及多態(tài)性驗(yàn)證后，篩選了11條ISSR引物，共擴(kuò)增了2126條條帶，多態(tài)性達(dá)到100％，同時(shí)通過(guò)UPGMA聚類分析將茶枝柑及近緣種38份材料在相似系數(shù)0.54～0.94水平上得以區(qū)分。
　　2.探討了SCoT分子標(biāo)記對(duì)比ISSR分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)以及結(jié)合分析效果。以L25正交方法

5、對(duì)SCoT反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化得到最佳體系為1×PCR buffer，2mmol/L Mg2+，0.25mol/L dNTPs，0.625μ mol/L primer，0.5U Taq酶，20ng模板DNA。最終篩選出了12條引物對(duì)38份茶枝柑及近緣種遺傳多態(tài)性分析，共擴(kuò)增了2846條條帶，多態(tài)位點(diǎn)百分率占98.7％。在相似系數(shù)為0.54～0.91水平上38份材料得以區(qū)分。因此不管是SCoT還是ISSR分子標(biāo)記均能將38份供試材料分開(kāi)，雖有

6、一定的差異，但是從總體上來(lái)看結(jié)果大致相同，說(shuō)明SCoT和ISSR分子標(biāo)記是進(jìn)行茶枝柑及近緣種分子鑒定的有效工具。
　　3.SCOT分子標(biāo)記結(jié)合克隆測(cè)序?qū)Σ柚Ω碳敖壏N進(jìn)行了序列比對(duì)分析，同源性為63.84％，而遺傳距離則在0.001～0.654之間，基于Kimura遺傳距離分析材料間的Phylogenetic Tree發(fā)現(xiàn)聚為三類，每一種供試材料都存一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)可以作為特異位點(diǎn)與其他供試材料區(qū)分開(kāi)。因此驗(yàn)證了SCoT分子標(biāo)記

7、技術(shù)結(jié)合克隆測(cè)序在茶枝柑及近緣種的分子鑒別研究是有效的。
　　4.通過(guò)4條國(guó)際通用條形碼對(duì)茶枝柑及近緣種的篩選鑒別，其中marK序列測(cè)序成功率為50％，rbcL序列變異位點(diǎn)為0，而B(niǎo)LAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)ITS2和psbA-trnH鑒別效率均為100％，因此最終選用了ITS2和psbA-trnH序列作為材料鑒別條形碼，通過(guò)組合序列分析材料區(qū)分度高于單條形碼，因此推薦ITS2+psbA-trnH序列作為茶枝柑及近緣種的鑒別序列。
　

8、　5.在分子水平上對(duì)茶枝柑駁枝和芽枝區(qū)分，通過(guò)4條國(guó)際條形碼篩選，其中ITS2、psbA-trnH和matK序列中均未發(fā)現(xiàn)差異位點(diǎn)，而在rbcL序列上芽枝和駁枝得以完全區(qū)分，為茶枝柑選苗選育上提供了廣泛前景及應(yīng)用價(jià)值。
　　6.建立了cCTAB法作為茶枝柑果皮的有效提取方法，較試劑盒法提高了十倍多產(chǎn)率，而不同貯存年限茶枝柑果皮DNA含量與時(shí)間并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。通過(guò)茶枝柑果皮與其葉的psbA-trnH序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)完全一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了D

9、NA條形碼的鑒定優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)論:
　　ISSR分子標(biāo)記結(jié)合SCoT分子標(biāo)記的遺傳多態(tài)性高，茶枝柑及近緣種在UPGMA聚類樹(shù)幾乎完全得以區(qū)分。SCoT分子標(biāo)記結(jié)合克隆測(cè)序得到多個(gè)變異位點(diǎn)，可以作為材料的區(qū)分位點(diǎn)。ITS2結(jié)合psbA-trnH序列適合作為茶枝柑及近緣種的條形碼鑒別序列。rbcL序列水平上可將兩種繁育方式的茶枝柑完全得以區(qū)別。cCTAB法能有效提取10年以上茶枝柑果皮DNA，同時(shí)通過(guò)psbA-trnH序列比對(duì)，