青蝦卵黃蛋白原和卵黃蛋白原受體基因的克隆及功能研究.pdf

1、青蝦學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)俗稱河蝦，廣泛分布在我國(guó)淡水水域。屬于節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)。近年來(lái)，隨著青蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；瘮U(kuò)大、年產(chǎn)量的提高，在生產(chǎn)中出現(xiàn)了一系列亟待解決的難題，其中青蝦個(gè)體小型化“性早熟”問(wèn)題最為突出。在養(yǎng)殖池塘中小蝦性腺過(guò)早成熟產(chǎn)卵

2、，導(dǎo)致青蝦個(gè)體變小、池塘養(yǎng)殖密度過(guò)大、多代同堂等一系列問(wèn)題，制約著青蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。性腺的成熟與生殖調(diào)控基因密切相關(guān)，參與生殖調(diào)控的基因很多，其中卵黃蛋白原(Vitellogenin, Vg)和卵黃蛋白原受體(Vitellogenin recep tor, VgR)在卵子發(fā)生過(guò)程中起著十分關(guān)鍵的作用。目前，在青蝦中曾經(jīng)克隆了Vg基因的短片段，但對(duì)于其功能研究還未見(jiàn)報(bào)道，關(guān)于VgR基因的研究還十分薄弱。本研究以青蝦為研究對(duì)象，擬開(kāi)

3、展卵黃蛋白原基因和卵黃蛋白原受體基因的研究，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的精卵巢文庫(kù)獲取的基因短片段，采用cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技術(shù)克隆獲得了Vg基因和VgR基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并研究了在不同組織、成體不同發(fā)育時(shí)期、卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律;與此同時(shí)，通過(guò)眼柄摘除和RNAi，研究了Mn-VgR和Mn-Vg基因的功能以及在卵子發(fā)生過(guò)程中之間的相互調(diào)控關(guān)系。
　　采

4、用RACE技術(shù)獲得青蝦Vg基因的全長(zhǎng)cDNA序列全長(zhǎng)約7804bp，ORF共編碼2536個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為286.810 kDa，熒光定量結(jié)果表明，Mn-Vg基因在雌蝦的肝胰腺、血淋巴和卵巢中高表達(dá)，其中肝臟表達(dá)量最高。在雄蝦的各個(gè)組織基本不表達(dá)。Mn-Vg在胚胎發(fā)育的原腸期和溞狀幼體期表達(dá)量較高。在出膜第一天表達(dá)量達(dá)到峰值，之后一直降低，在變態(tài)后第20天開(kāi)始表達(dá)并持續(xù)升高。隨著卵巢的發(fā)育，Mn-Vg在卵巢和肝臟中都呈現(xiàn)先升高后

5、下降的趨勢(shì)，在肝臟中，Mn-Vg在卵巢發(fā)育的第Ⅱ期開(kāi)始升高并在第Ⅲ期達(dá)到峰值，隨著卵巢產(chǎn)卵表達(dá)量降低。在卵巢中，Mn-Vg表達(dá)量在卵巢發(fā)育的第Ⅱ期開(kāi)始時(shí)上升到成熟期Ⅴ期達(dá)到峰值，隨著卵巢產(chǎn)卵表達(dá)量降低。眼柄摘除后，通過(guò)解除眼柄中激素對(duì)性腺的抑制作用，從而加速了卵巢的發(fā)育。 Mn-Vg在肝臟和卵巢中表達(dá)量和對(duì)照組相比都明顯升高，在肝臟中升高的幅度更大。在一次注射實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)注射4ug/g的Vg dsRNA明顯降低了卵巢和肝臟中Mn-Vg的

6、表達(dá)。在注射后的第五天Mn-Vg表達(dá)量分別降低到原來(lái)水平的3％和8％。二次注射實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)Vg dsRNA能夠顯著的延緩卵巢發(fā)育的速度。VgRNAi還能夠下調(diào)卵巢中VgR基因的表達(dá)，表明了兩者之間重要的調(diào)控關(guān)系。
　　根據(jù)RACE技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的文庫(kù)，克隆獲得了Mn-VgR基因全長(zhǎng)cDNA為5920bp，其中5'末端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions，UTR)為45 bp，開(kāi)放閱讀框ORF(Open Readi

7、ng Frame，ORF)為5709 bp、3'UTR為166 bp。Mn-VgR基因的開(kāi)放閱讀框共編碼1902個(gè)氨基酸殘基分子量為209kDa。Mn-VgR氨基酸序列具有LDL家族典型的保守結(jié)構(gòu)域如:配體結(jié)合區(qū)域（Ligand-binding domain, LBD）、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor-precursor, EGF)前體結(jié)構(gòu)域、O-連接的結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)。熒光定量PCR結(jié)果表明，Mn

8、-VgR只在卵巢中高表達(dá)，在肝臟和肌肉中表達(dá)量較低，其他組織中幾乎不表達(dá)。Mn-VgR在胚胎發(fā)育的卵裂期表達(dá)水平最高，之后表達(dá)水平逐步降低且一直處于低水平。在變態(tài)后的第20天開(kāi)始表達(dá)，并逐漸升高。隨著卵巢的發(fā)育，Mn-VgR在卵巢發(fā)育的第Ⅰ期表達(dá)逐漸升高并在第Ⅲ期到達(dá)峰值，之后一直處于較低水平，在生殖蛻皮之后進(jìn)入下一個(gè)卵巢發(fā)育周期。眼柄摘除引起了卵巢和肝臟中Mn-VgR在卵黃發(fā)生過(guò)程中的顯著升高(P＜0.05)。在成體雌蝦中，根據(jù)性腺發(fā)

9、育指數(shù)(Gonado somatic index, GSI)變化規(guī)律，表明VgRRNAi能夠延緩性腺發(fā)育的周期。4ug/gVgR dsRNA之后，卵巢中VgR的表達(dá)量顯著降低，在第五天下降了92％。同時(shí)VgR RNAi也引起了卵巢中Mn-Vg含量的降低和肝臟中Mn-Vg表達(dá)量的升高。
　　本研究首次克隆了青蝦Vg和VgR的全長(zhǎng)cDNA序列，確定了Vg-和VgR在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期以及卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)模式