Furin和NPAS4對阿爾茨海默病的神經保護作用及機制研究.pdf

1、背景：阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是最常見的神經退行性疾病，其主要神經病理學特征包括細胞外神經炎性斑（senile plagues, SPs，又稱老年斑）、細胞內神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles, NFTs）以及由此造成的神經元和神經突觸的缺失。AD的病因及其發(fā)病過程仍未徹底闡明，但目前已確定Aβ沉積是老年斑的主要成分，而tau蛋白過度磷酸化導致神經元纖維纏結。
　　

2、神經生長因子（NGF）已用來治療AD并進入II期臨床試驗。而研究發(fā)現(xiàn)介導NGF由前體NGF轉化而來的Furin在AD腦中也降低。Furin是一種前體蛋白轉化酶，它還催化腦源性神經生長因子（BDNF）前體和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的成熟。這表明Furin在AD發(fā)病中的作用可能遠大于NGF。
　　目的：本研究（1）通過建立穩(wěn)定表達Furin的神經元細胞系，分析Furin與細胞凋亡、內

3、質網應激之間的關系以及Furin對Abeta代謝的影響；（2）通過真核表達質粒NPAS4轉染原代神經元，分析NPAS4與tau蛋白清除之間的關系，基本解明Furin和NPAS4在AD病理環(huán)節(jié)中的作用及機制，為篩選治療AD的靶分子奠定基礎。
　　方法：神經元細胞系SH-SY5Y轉染Furin后經過篩選建立穩(wěn)定表達Furin的細胞系，然后采用免疫印跡（Western blot，WB）方法檢測自噬、凋亡、內質網應激及其Abeta代謝相關

4、分子。通過真核表達質粒NPAS4轉染原代神經元，采用免疫熒光（Immunofluorescence，IF）和免疫印跡（Western blot，WB）方法分析自噬相關分子的變化及其tau蛋白表達情況，然后用自噬藥物處理細胞后WB檢測tau蛋白變化。
　　結果：（1）Furin過表達能誘導自噬、保護氧化應激誘導的凋亡、抑制內質網應激。我們還發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定表達Furin的細胞中，IRE1α的磷酸化顯著增加，在H2O2和Tunicamyc

5、in存在時更加明顯。但PERK、ATF6的變化不顯著，提示Furin選擇性激活了IRE1α，但這一現(xiàn)象還需要動物實驗驗證。（2）JNK和ERK是IRE1α的下游分子，IRE1α在ERS時獨立促進了依賴于JNK的自噬，且這種作用只依賴于IRE1α的激酶活性，而與IRE1α的內切酶活性無關。結果提示IRE1α可能是通過JNK/ERK調節(jié)自噬的。因此我們推測Furin促進自噬的作用可能與IRE1α-JNK/ERK通路有關。（3）Furin能影

6、響APP代謝酶類和減少Aβ產生。根據(jù)以上結果我們推測：Furin一方面通過BDNF促進神經元樹突生長和學習和記憶，并對抗氧化應激損傷和凋亡；另一方面Furin通過IRE1α-自噬途徑，以及通過影響ADAM10/PS1活性，最終減輕Aβ沉積，從而改善AD的認知障礙。（4）NPAS4過表達誘導神經元自噬。CQ處理后LC3-II和p62蛋白水平增加比NPAS4組更明顯，說明NPAS4能誘導自噬通量。（5）自噬抑制（3-MA或CQ）或誘導（血清

7、饑餓）后，我們發(fā)現(xiàn)，血清饑餓誘導的自噬降低了內源性總的和磷酸化tau蛋白水平，在NPAS4過表達時這一現(xiàn)象更加明顯。3-MA或CQ處理后內源性總的和磷酸化tau蛋白均升高，但是NPAS4過表達反轉了它的提高。這些結果表明自噬活性提高對tau蛋白的清除是有益的。（6）我們用MG132抑制UPS后發(fā)現(xiàn)tau清除被抑制，同時MG132并沒有影響自噬（LC3-II沒變），暗示出NPAS4可能通過一個未知的UPS機制清除tau蛋白。（7）NPAS

8、4并沒有影響使tau磷酸化的激酶。
　　結論：Furin一方面通過BDNF促進神經元樹突生長和學習和記憶，并對抗氧化應激損傷和凋亡；另一方面Furin通過IRE1α-自噬途徑，以及通過影響ADAM10/PS1活性，最終減輕Aβ沉積，從而改善AD的認知障礙。NPAS4過表達能誘導自噬并降低內源性tau表達，且這一機制由自噬介導。Tau蛋白尤其是磷酸化tau蛋白的清除對于治療AD等tau病具有重要意義。因此本研究的發(fā)現(xiàn)可能對于神經退行