反義表達(dá)Calnexin轉(zhuǎn)基因番茄株系的獲得及研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的類凝集素分子伴侶主要有鈣聯(lián)蛋白Calnexin和鈣網(wǎng)蛋白Calreticulin兩種.Calnexin是一種Ca<'2+>結(jié)合的I型跨膜蛋白,主要是輔助N-連接糖蛋白的折疊和裝配過(guò)程.Calnexin參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)量控制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、Ca<'2+>穩(wěn)態(tài)平衡等過(guò)程,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不可缺少的分子伴侶成員.calnexin在動(dòng)物、植物和微生物中有廣泛的分布,而且對(duì)各物種的calnexin的序列分析發(fā)現(xiàn)它在不同

2、物種之間的具有結(jié)構(gòu)和序列上的進(jìn)化保守性.雖然類凝集素分子伴侶Calnexin發(fā)現(xiàn)的比較早,但是對(duì)它的研究主要集中在動(dòng)物中,而對(duì)植物中Calnexin的功能方面的研究較少.最近本實(shí)驗(yàn)室從番茄中克隆得到了全長(zhǎng)calnexin cDNA基因全序,并命名為L(zhǎng)ecnx61.0(AB218598).已有研究表明.Lecnx61.0基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上受熱激、冷害、鹽脅迫條件的誘導(dǎo),但對(duì)干旱脅迫沒(méi)有明顯的響應(yīng). 為了了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類凝集素分

3、子伴侶Calnexin在植物抵抗逆境過(guò)程中的功能,本實(shí)驗(yàn)利用反義技術(shù),抑制.Lecnx61.0基因在番茄中的表達(dá).結(jié)果表明,抑制Lecnx61.0基因表達(dá)后番茄的耐受鹽脅迫的能力較對(duì)照并無(wú)明顯差異.本論文主要結(jié)果如下:1、轉(zhuǎn)反義Lecnx61.0番茄的獲得 選取Lecnx61.0 cDNA 3'端的351 bp的DNA片段構(gòu)建反義表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法轉(zhuǎn)化番茄,共得到9個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化系.對(duì)轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè),初步證明外

4、源基因已經(jīng)整合到番茄基因組中.利用Calnexin蛋白特異的抗體進(jìn)行Western雜交,結(jié)果表明反義轉(zhuǎn)基因株系中Calnexin蛋白量確實(shí)出現(xiàn)了明顯降低,不同轉(zhuǎn)化株系反義抑制的效果是有差異的.2、轉(zhuǎn)基因番茄的抗鹽性分析 用150 mmol/L的NaCl溶液對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株進(jìn)行脅迫處理.脅迫處理30天后,鹽脅迫條件下植物生長(zhǎng)均受到明顯抑制,部分葉片枯黃,反義轉(zhuǎn)基因番茄的生長(zhǎng)情況與對(duì)照番茄無(wú)明顯差異.對(duì)鹽處理后的轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)