豬體細胞核移植及其相關技術研究.pdf

1、體細胞克隆豬在人的動物疾病模型和人類異種器官移植方面具有巨大優(yōu)勢和應用潛力，已經成為當今體細胞克隆領域研究的熱點。雖然體細胞克隆豬在幾個國家已獲得成功，但其克隆效率仍很低(1-2％)。本研究以建立高效的豬體細胞核移植技術體系為目的，系統(tǒng)地研究了影響豬體細胞核移植效率的因素，通過優(yōu)化相關技術，改善培養(yǎng)條件，達到穩(wěn)定、大量地生產克隆胚胎，并進行胚胎移植以期獲得克隆豬的出生。 本研究利用組織塊法建立了廣西巴馬香豬的40d胎兒成纖維細胞

2、系、成年耳成纖維細胞系，以機械刮取法建立了輸卵管上皮細胞系，并分離培養(yǎng)了豬卵泡液中的顆粒細胞，研究了凍存對胎兒成纖維細胞的影響以及胎兒成纖維細胞的生長曲線和染色體倍性。實驗結果表明，凍存后的胎兒成纖維細胞仍能保持良好的生長狀態(tài)，細胞生長曲線呈典型的S型，在傳代10次之前，染色體倍性正常的比例在92％以上。利用脂質體法轉染了質粒pEGFP-c1，研究了細胞密度、DNA、脂質體的用量、DNA脂質體復合物的暴露時間對轉染效率的影響。結果表明：

3、24孔板內細胞匯合85％-90％，1.0μg DNA和2.4μL脂質體的用量，暴露4h轉染效率最高。 優(yōu)化了卵母細胞體外成熟體系：在NCSU-23+10％PFF中培養(yǎng)的卵母細胞成熟率最高(79.08％)，FBS對卵母細胞體外成熟作用不大；成熟培養(yǎng)液NCSU-23的成熟培養(yǎng)效果略高于TCM 199；在NCSU-23培養(yǎng)液中添加EGF對成熟效率影響不大。 經多次孤雌激活實驗表明，以200V/mm，60μs，1DC的處理效果最

4、佳；電激活后分別在成熟培養(yǎng)液中添加2mM 6-DMAP進行化學處理，所得的卵裂率略高于對照組、囊胚率顯著高于對照組；20μM/L離子霉素激活處理40min激活效果最好；體外成熟培養(yǎng)36h、40h、52h的卵母細胞在卵裂率和囊胚率上明顯不如44h、48h，成熟培養(yǎng)48h的卵母細胞卵裂率最高可達81.75％，44h囊胚率最高為22.22％。 血清饑餓法和接觸抑制法對供核細胞進行細胞周期化處理，誘導細胞進入G0/G1期。各組之間的卵裂

5、率、囊胚率差異不顯著，經血清饑餓的供體細胞所得的囊胚率較高。比較了盲吸法、Spindle-view去核法，發(fā)現Spindle-view法的去核率可以達到95.76％，是一種安全、高效的去核方法。以胎兒成纖維細胞作為供核體細胞構建的重構胚后期發(fā)育效果良好；1.0代以內的胎兒成纖維細胞更有利于重構胚的發(fā)育，融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200v，60us，1DC電激活后，在以B2為培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系中進行培養(yǎng)，無論在重構胚的融合率、卵裂率和囊