成年大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)功能性的L-型鈣通道.pdf

1、成年哺乳動(dòng)物大腦可以產(chǎn)生新的神經(jīng)元，這一發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重大突破。非常有趣的是這種腦結(jié)構(gòu)可塑性的新模式僅發(fā)生在一些離散的腦區(qū)，目前大多數(shù)的研究者都把目光聚焦在腦室下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬結(jié)構(gòu)中的齒狀回(dentate gyms，DG)。在過去的二十年問，該領(lǐng)域主要有兩個(gè)研究方向：1)神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞(和它們的子代細(xì)胞)的生物學(xué)特性和新生神經(jīng)元如何整合到已存在的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中；2)這些新生神經(jīng)元在腦功能

2、中的作用。方法學(xué)問題阻礙了這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展，但是也取得了相當(dāng)大的進(jìn)展。目前人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制和外在因子共同參與了成年神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)，而且環(huán)境和生理狀況也可以影響神經(jīng)再生，另外，神經(jīng)再生也參與了一些腦疾病的病理過程。 目前人們大多使用BrdU來研究體內(nèi)的神經(jīng)再生。雖然用BrdU有很多優(yōu)點(diǎn)，但是也存在不少缺點(diǎn)。因此，研究成年神經(jīng)再生必須先從細(xì)胞(分子)水平開始，然后結(jié)合在體研究，從而提高研究結(jié)果的可靠性。而其中一個(gè)前提條件就是需要建

3、立神經(jīng)前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)。 成年大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直以來是一件比較棘手的事情。目前國(guó)際上培養(yǎng)成年神經(jīng)前體細(xì)胞有兩種方法：懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)目前還存在爭(zhēng)議，一部分學(xué)者認(rèn)為懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆并非神經(jīng)球。貼壁培養(yǎng)國(guó)際上僅Gage小組一家，同時(shí)也是目前被廣為認(rèn)可的培養(yǎng)方法。國(guó)內(nèi)也一直沒有實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)過用貼壁法培養(yǎng)成年大鼠的海馬神經(jīng)前體細(xì)胞。 L-型鈣通道在神經(jīng)發(fā)育過程中具有重要作用，并且有報(bào)道電壓依賴性

4、鈣通道 參與了胚胎HPCs向神經(jīng)元分化的調(diào)控。但在成年的HPCs上是否表達(dá)L-型鈣通道目前尚未見報(bào)道。 本研究的目的是在參照Gage's方法的基礎(chǔ)上建立一種能夠獲得高純度成年Wistar大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞(HPCs)的體外貼壁培養(yǎng)方法，并鑒定HPCs上是否存在功能性L-型鈣通道。 本實(shí)驗(yàn)取Wistar成年雌性大鼠海馬組織，制成單細(xì)胞懸液，利用無血清培養(yǎng)技術(shù)，在添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、

5、N-2和B27supplement的DMEM/F12培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中我們發(fā)現(xiàn)，前三代細(xì)胞形態(tài)主要呈多角型有粗大突起，似星形膠質(zhì)細(xì)胞，部分細(xì)胞呈圓形，有的呈分裂相。第四代時(shí)一種體積較小、呈圓形、周圍長(zhǎng)有細(xì)小突起的細(xì)胞逐步代替了原來的細(xì)胞。Alvarez-Buylla和Kaplan and Bell研究證實(shí)，成年哺乳動(dòng)物海馬存在兩種神經(jīng)前體細(xì)胞，一種細(xì)胞相當(dāng)于SVZ中的B細(xì)胞，表達(dá)GFAP；另一種細(xì)胞由B細(xì)胞產(chǎn)生，體積較B細(xì)胞

6、小，稱為D細(xì)胞。以上表明我們體外培養(yǎng)的結(jié)果與上述報(bào)導(dǎo)是一致的。前四代細(xì)胞以B細(xì)胞為主，隨著傳代的進(jìn)行B細(xì)胞逐漸生成了D細(xì)胞。采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)原代和第六代細(xì)胞分別進(jìn)行鑒定，呈巢蛋白(Nestin)陽性的細(xì)胞分別達(dá)66.7％和99.9％。 在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5μmol/L的BrdU，作用24小時(shí)，BrdU與nestin免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細(xì)胞都同時(shí)表達(dá)這兩種抗原，說明細(xì)胞處于活躍的分裂增殖期。 把培養(yǎng)的高純度的細(xì)胞在分化培養(yǎng)基

7、中誘導(dǎo)分化，分化第五天細(xì)胞就表現(xiàn)為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，分化第14天細(xì)胞免疫熒光分別呈Ⅲ型β-微管蛋白(Tujl)陽性和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性。細(xì)胞來源于成年神經(jīng)組織的未分化細(xì)胞、具有自我復(fù)制能力、可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)前體細(xì)胞。 細(xì)胞免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示HPCs表達(dá)L-型鈣通道的Cavl.2a<,1>C和Cavl.3a<,1>D亞單位。 共聚焦鈣成像證明了HPCs上存在功

8、能性L-型鈣通道。首先我們?cè)诩?xì)胞外液中加入20mmol/L的KCl后，觀察到熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(F/FO=1.17±0.03，p<0.001，n=37)，表明去極化可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]<,i>增加。洗去KCl加入L-型鈣通道特異性阻斷劑Nifedipine(10μmol／L)，這時(shí)熒光強(qiáng)度略有降低(p<0.05)，稍后再加入KCl，同一視野相同細(xì)胞上未見熒光強(qiáng)度的顯著增強(qiáng)(F／FO=1.03±0.02，p>0.05)。用Nife

9、dipine的溶劑乙醇(1‰)處理HPCs，KCl仍可誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(F／FO=1.43±0.06，p<0.001，n=10)，表明Nifedipine的作用不是乙醇所致。另外，在無鈣細(xì)胞外液中加入KCl后未見熒光強(qiáng)度的顯著增強(qiáng)(F／FO=1.01±0.01，p>0.05，n=10)。以上結(jié)果表明L-型鈣通道介導(dǎo)了KCl誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。(F／FO均為加入KCl后第80秒)。進(jìn)一步我們用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄到了L-型鈣電流：當(dāng)電壓

10、從-30 mV直接去極化到10 mV，平均電流為100 pA±2.35 pA；特異性的L-型鈣通道激動(dòng)劑BayK8644(1μmol／L)使該電流顯著增加至150 pA±15.15 pA(n＝3)，與正常對(duì)照組比，差異顯著(P<0.05)；而1 μmol／L的特異性阻斷劑尼氟地平(Nifedipine)可明顯使該電流降低到正常對(duì)照組的65％左右(P<0.05)，10μmol／L尼氟地平幾乎完全抑制了該電流。 以上結(jié)果表明成年Wi