小豬急性肝衰竭模型的蛋白組學(xué)研究及臨床驗(yàn)證.pdf

1、背景:
　　肝臟疾病種類繁多，病因復(fù)雜，每年因肝臟疾病死亡的人數(shù)逐年增加。其中，急性肝衰竭是一種病情發(fā)展迅速，死亡率高且治療手段有限的疾病，早期及時的診斷及準(zhǔn)確適宜的治療手段是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。
　　目的:
　　本研究通過對實(shí)驗(yàn)小豬急性肝衰竭模型的序貫性血樣的血清蛋白組學(xué)研究，描述疾病過程中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，篩選潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，最終轉(zhuǎn)化至臨床驗(yàn)證，為急性肝衰竭的早期診斷及預(yù)后提供依據(jù)。
　　方法:
　

2、　選取38頭實(shí)驗(yàn)小豬靜脈給藥D-氨基半乳糖(1.3g/kg)建立急性肝衰竭模型。給藥前(P0)及給藥后36小時(P36)的混合血清(n=10)經(jīng)利用肽配體庫(CPLL)技術(shù)處理后分為高豐度表達(dá)部分(HAP)及低豐度表達(dá)部分(LAP)，通過蛋白組非標(biāo)記定量(LFQ)檢測獲得差異蛋白列表。另選8頭實(shí)驗(yàn)小豬動態(tài)時間點(diǎn)的血清樣品，預(yù)處理后經(jīng)平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）靶向定量初篩所得的差異蛋白列表。同時，對實(shí)驗(yàn)小豬不同時間點(diǎn)的肝組織進(jìn)行透視電鏡、病理

3、學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及免疫組化等綜合評估，從基因水平到組織蛋白水平檢驗(yàn)最終選擇的蛋白標(biāo)志物。最后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分別檢測急性肝衰竭患者及健康人的血清蛋白標(biāo)志物（果糖-1，6-二磷酸酶，F(xiàn)BP1;視黃醇結(jié)合蛋白4，RBP4）濃度。
　　結(jié)果:
　　基于數(shù)據(jù)依賴性采集(DDA)所得的鳥槍法對比檢測正常狀態(tài)及急性肝衰竭狀態(tài)下的小豬血清(n=10)蛋白質(zhì)表達(dá)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)1589種血清蛋白質(zhì)，其中變化顯著的

4、差異蛋白325種。繼而經(jīng)過數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)檢測，結(jié)果分析可得可靠蛋白譜圖137種，蛋白質(zhì)生物功能分析提示其中線粒體及能量代謝蛋白變化最為顯著，共20種。平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）外部檢驗(yàn)另8頭實(shí)驗(yàn)小豬完整時間點(diǎn)的20種能量代謝相關(guān)蛋白的動態(tài)變化。結(jié)果提示除了視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)給藥后即急速下降、剩余19種蛋白質(zhì)均持續(xù)上升。同時，透視電鏡可見急性肝衰竭狀態(tài)下的肝細(xì)胞線粒體退行性改變，體積明顯腫脹、嵴消失、數(shù)目明顯減少;線粒體

5、特異性基因（細(xì)胞色素氧化酶1/2，COX1/2）的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示其基因表達(dá)量給藥后顯著減少。最終選擇視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）和果糖-1，6-二磷酸酶(FBP1)為候選蛋白標(biāo)志物。對候選標(biāo)志物的小豬肝臟免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果與血清蛋白組學(xué)結(jié)果一致。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測急性肝衰竭患者血清，可見相比健康人，急性肝衰竭患者血清果糖-1，6-二磷酸酶濃度明顯升高(p＜0.05)、視黃醇結(jié)合蛋白4濃度顯著降低(p＜0.001

6、)。根據(jù)隨訪資料對急性肝衰竭患者進(jìn)行短期（30天）生存分析，發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸酶具有與肝病終末期模型(MELD)評分相當(dāng)?shù)亩唐陬A(yù)后價值（曲線下面積AUC=0.778），且血清濃度高的患者(＞16.89μg/dL)相比濃度低的患者預(yù)后較差。
　　結(jié)論:
　　急性肝衰竭過程中線粒體形態(tài)功能均明顯受損，能量代謝相關(guān)蛋白持續(xù)性升高。其中，視黃醇結(jié)合蛋白4及果糖-1，6-二磷酸酶可能可以作為急性肝衰竭的早期診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志