miR-17-5p通過調控極低密度脂蛋白受體的表達參與動脈粥樣硬化發(fā)生機制的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性疾病，主要癥狀為大中動脈內膜下脂質沉積，內膜增厚，形成粥樣斑塊。動脈粥樣硬化是中風、心肌梗死、缺血性心力衰竭和其他心臟病的主要原因，在西方國家，50％的死亡根本原因為動脈粥樣硬化。在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中，血管平滑肌細胞的作用至關重要，它的異常增殖、遷移和分化導致了血管的病理學變化。內膜增厚也是動脈粥樣硬化發(fā)展中的一項典型病理特征。miRNA在基因轉錄后水平的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，它能夠與靶基因mRNA的3'

2、UTR區(qū)堿基互補，引導沉默復合物降解靶標分子或者抑制mRNA的翻譯。在過去十年的研究中表明，miRNA在各種心血管疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮調控作用。也有一些研究表明，動脈粥樣硬化的發(fā)生與miRNA的異常表達高度相關。曾經有報道m(xù)iR-17-5p可以用來作為診斷冠狀動脈粥樣硬化的分子標記，具有很高的特異性和靈敏度。但是miR-17-5p在動脈粥樣硬化發(fā)展中的具體作用和機制還不清楚，因此，本研究通過臨床樣本檢測、動物和細胞實驗，初步探討miR-

3、17-5p在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用和機制。
　　極低密度脂蛋白受體(VLDLR)屬于LDLR超家族的成員之一，是主要在心臟、肌肉、脂肪細胞和腦中表達的外周脂蛋白受體。它能夠與含有載脂蛋白E的脂蛋白結合，如極低密度脂蛋白、乳糜微粒、中間密度脂蛋白等。在LDLR缺陷型小鼠中用腺病毒介導的肝臟中VLDLR過表達，顯示出VLDLR在預防動脈粥樣硬化病變形成以及脂肪條紋病變的潛力。目前認為，VLDLR也是動脈粥樣硬化表達中重要的調控因子。

4、本研究發(fā)現，VLDLR可能是miR-17-5p的潛在靶分子，基于此預測，本研究提出了一條基于新的miRNA調控通路的科學假設并進行實驗研究，具有十分重要的理論和應用價值，有利于探索新的藥物靶點，將會為動脈粥樣硬化的診斷和治療提供新的方向。以下為本研究各部分內容的概述:
　　第一部分動脈粥樣硬化患者中miR-17-5p與VLDLR的表達相關性
　　目的:明確動脈粥樣硬化發(fā)病與miR-17-5p、VLDLR的相關性。
　　

5、方法:以30對來源于動脈粥樣患者和健康人群的外周血樣本為研究材料，通過Real-time PCR檢測各樣本中miR-17-5p和VLDLR mRNA表達量，對比miR-17-5p及VLDLR在動脈粥樣硬化組和健康對照組之間的表達差異。
　　結果:Real-time PCR檢測miR-17-5p表達結果顯示，動脈粥樣硬化患者外周血中的miR-17-5p的表達量顯著高于對照組(P＜0.01)。Real-time PCR檢測VLDLR的

6、結果顯示，VLDLR mRNA表達水平顯著低于對照組（P＜0.01）。
　　結論:(1)動脈粥樣硬化發(fā)病與外周血中miR-17-5p的表達水平呈正相關。(2)動脈粥樣硬化發(fā)病與外周血中VLDLR的表達水平呈負相關。
　　第二部分動脈粥樣硬化小鼠中miR-17-5p對動脈粥樣硬化的影響
　　目的:探討miR-17-5p對動脈粥樣硬化小鼠的影響，初步闡述其作用機制;評估m(xù)iR-17-5p作為治療動脈粥樣硬化靶位點的應用價值

7、。
　　方法:用高脂飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠12周構建動脈粥樣硬化小鼠模型，注射antagomiR-17-5p及NC miRNA干擾小鼠體內的miR-17-5p的表達。通過HE染色檢測各組小鼠動脈血管的病理變化，測量各組小鼠血管內膜、中膜面積，計算內膜/中膜面積比(I/M)，測量管腔面積，探討干擾miR-17-5p對動脈粥樣硬化的治療作用。通過免疫熒光、Real-time PCR、Western blot檢測各組小鼠動脈組織中VLD

8、LR的表達，Real-time PCR、Western blot檢測PCSK9的表達，Western blot檢測Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP蛋白的表達， ELISA檢測血管炎癥因子(TNF-α、IL-6，IL-10)水平，試劑盒法檢測MDA、SOD及髓過氧化物酶(MPO)水平及活性，進一步探討miR-17-5p作用的分子機制。
　　結果:HE染色結果顯示AS小鼠與對照組相比，其

9、血管內皮形成了明顯的斑塊，平滑肌細胞排列紊亂，內膜增生，而antagomiR-17-5p處理的小鼠與NC miRNA組相比，病變程度明顯減輕。動脈粥樣硬化小鼠比對照小鼠的內膜面積明顯增加，抑制miR-17-5p的作用之后，內膜面積減少;各組小鼠中中膜面積差異不顯著。計算I/M值，antagomiR-17-5p組小鼠比NC-miRNA組顯著減小(P＜0.05)。AS模型組和NC-miRNA組小鼠的血管管腔面積比對照組明顯減小，而antag

10、omiR-17-5p組則緩解了這種作用，結果差異具有顯著性(P＜0.05)。免疫熒光、Real-time PCR、Western blot檢測各組小鼠動脈組織中VLDLR的表達，結果顯示動脈粥樣硬化小鼠中VLDLR的表達量顯著下降，抑制miR-17-5p的作用使得VLDLR水平上升。通過Real-time PCR和Western blot檢測PCSK9在mRNA和蛋白水平上的表達變化，結果與VLDLR相反，在AS模型組中PCSK9在mR

11、NA和蛋白水平上的表達量均顯著上調，在antagomiR-17-5p組中表達量顯著下調。Western blot檢測結果顯示，動脈粥樣硬化小鼠中Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達水平上調，Bcl-2水平降低，抑制miR-17-5p的作用使Bax、Cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達水平降低，Bcl-2水平上調;ELISA檢測結果顯示，AS模型小鼠TNF-α、IL-6水平升

12、高，IL-10水平降低，抑制miR-17-5p的作用后則TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平上調;細胞氧化應激指標檢測結果表明，AS模型小鼠MDA、MPO水平上調，SOD活性降低，抑制miR-17-5p的作用能夠抑制MDA、MPO水平及活性，上調SOD酶活性。
　　結論:(1)抑制miR-17-5p對小鼠中的動脈硬化具有顯著的治療作用，能夠有效緩解動脈粥樣硬化小鼠動脈血管的病理變化，減少斑塊的形成，緩解AS造成的內膜增生和

13、管腔狹窄。(2)干擾miR-17-5p的表達量上調動脈組織中VLDLR的表達量。(3)干擾miR-17-5p的表達量下調動脈組織中PCSK9的表達。(4)干擾miR-17-5p的表達量抑制動脈組織中細胞凋亡。(5)干擾miR-17-5p的表達量抑制動脈組織中炎癥反應與氧化應激。
　　第三部分 miR-17-5p直接調控平滑肌細胞中VLDLR的表達
　　目的:探討miR-17-5p在血管平滑肌細胞中靶向VLDLR調控其表達的機

14、制;
　　方法:利用TargetScan對miR-17-5p和VLDLR之間的靶向調控關系進行了預測;體外培養(yǎng)人的血管平滑肌細胞，通過雙熒光素酶實驗驗證miR-17-5p對VLDLR的直接調控作用。在血管平滑肌細胞中轉染miR-17-5p inhibitor及其對照，然后通過Real-time PCR和Western blot檢測VLDLR的表達量。構建PCSK9重組質粒，轉染血管平滑肌細胞，然后通過Real-time PCR和W

15、estern blot檢測VLDLR的表達量變化。
　　結果:TargetScan在線網站對miR-17-5p與VLDLR之間相互作用的預測結果顯示VLDLR可能是miR-17-5p的潛在靶位點。在血管平滑肌細胞中進行的雙熒光素酶實驗結果顯示VLDLR3'UTR與miR-17-5p共轉染導致熒光素酶活性顯著下降，表明miR-17-5p能夠直接結合VLDLR3'UTR區(qū)，抑制VLDLR的表達。對VLDLR的Real-time PCR

16、和Western blot的檢測結果顯示轉染miR-17-5p inhibitor之后，VLDLR的表達量明顯上升(P＜0.01)。Real-time PCR和Western blot的檢測結果顯示轉染PCSK9之后，VLDLR的表達量明顯降低(P＜0.01)
　　結論:(1) miR-17-5p直接靶向VLDLR mRNA的3'UTR區(qū)，下調VLDLR的表達。(2)抑制血管平滑肌細胞中miR-17-5p的表達，可以提高VLDLR