異氟烷對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞胞葬作用及肺部炎癥恢復(fù)的影響.pdf

1、第一部分異氟烷預(yù)處理對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞胞葬作用的影響
　　目的：本研究從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)觀(guān)察吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對(duì)巨噬細(xì)胞胞葬作用的影響。
　　方法：從小鼠體內(nèi)提取骨髓衍生的巨噬細(xì)胞（BMDM）、肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞體外培養(yǎng)；用不同濃度0.5MAC、1MAC和2MAC的異氟烷預(yù)處理1h，用熒光染色的方法在體外監(jiān)測(cè)BMDM和肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡中性粒細(xì)胞的吞噬情況；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，方案一:隨機(jī)分為三組，CON組、BMDM組和IS

2、O組，首先用CLOD去除三組小鼠肺內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞，2天后，CON組小鼠氣管內(nèi)滴入相同體積的生理鹽水，而B(niǎo)MDM組和ISO組小鼠氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg），5天后給予CON組小鼠氣管內(nèi)相同體積的生理鹽水，給予BMDM組小鼠氣管內(nèi)滴入BMDM（2×106，40μL），給予ISO組小鼠氣管內(nèi)1MAC異氟烷預(yù)處理后BMDM（2×106，40μL）；方案二，隨機(jī)分為CON組、LPS組和LPS+ISO組，給予CON組小鼠氣管內(nèi)相同體積的生

3、理鹽水，給予LPS組和LPS+ISO組小鼠氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg），3天后給予LPS+ISO組小鼠吸入1MAC異氟烷1h,其他各組小鼠吸入空氣。2h后后收集兩種方案中三組小鼠肺泡灌洗液，通過(guò)甩片，用Diff-quick染色監(jiān)測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡中性粒細(xì)胞的吞噬情況。
　　結(jié)果：體外研究發(fā)現(xiàn)，與未處理組比較，1MAC和2MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠BMDM細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞清除能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而0.

4、5MAC異氟烷對(duì)小鼠BMDM細(xì)胞與未處理組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞清除能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，用濃度為1MAC異氟烷預(yù)處理的小鼠BMDM細(xì)胞1h后，BMDM細(xì)胞在肺里對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬功能明顯高于未處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與未處理組比較，用1MAC異氟烷處理后可以增強(qiáng)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬能力明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義（P<0.05）。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1MAC吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理1h可以增強(qiáng)小鼠BMDM細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的清除能力即增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的胞葬作用；體內(nèi)研究結(jié)果顯示1MAC吸入麻醉藥異氟烷處理后可以增強(qiáng)小鼠BMDM細(xì)胞的對(duì)凋亡細(xì)胞的清除能力，也可以增加小鼠肺內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力。
　　第二部分異氟烷預(yù)處理對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞胞葬作用機(jī)制的研究
　　目的：觀(guān)察吸入麻醉藥異氟烷對(duì)BMDM細(xì)胞Mer蛋白

6、表達(dá)變化、ADAM17的蛋白變化和AMPK的磷酸化變化的影響，探討吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對(duì)小鼠BMDM巨噬細(xì)胞胞葬作用機(jī)制。
　　方法：用不同濃度0.5MAC、1MAC和2MAC的異氟烷預(yù)處理BMDM細(xì)胞后，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，用免疫蛋白印記的方法檢測(cè)總蛋白Mer的變化；1MAC異氟烷預(yù)處理BMDM細(xì)胞后，處理后分別在0h、0.5h、1h、1.5h和2h，提取總蛋白、膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白和收集上清液中蛋白，用免疫蛋白印記的技術(shù)監(jiān)測(cè)總蛋

7、白、膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白和收集上清液中蛋白中蛋白Mer的變化；總蛋白、膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白中ADAM17的蛋白變化；及總蛋白中AMPK的激活情況；通過(guò)先加入AMPK抑制劑Compound C25μM或者用siRNA干擾沉默AMPK，后用1MAC異氟烷預(yù)處理細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)Mer蛋白的變化情況、ADAM17的蛋白變化和AMPK的磷酸化情況；通過(guò)用siRNA干擾沉默BMDM細(xì)胞內(nèi)AMPK，觀(guān)察異氟烷預(yù)處理對(duì)AMPK基因沉默后的BMDM細(xì)胞，觀(guān)察

8、BMDM細(xì)胞胞葬作用的變化。
　　結(jié)果：與未處理組比較，1MAC和2MAC異氟烷預(yù)處理組可以誘導(dǎo)BMDM細(xì)胞中Mer含量增加，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。0.5MAC異氟烷處理組和未處理組比較，兩組細(xì)胞內(nèi)Mer蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義；與未處理組比較，1MAC異氟烷預(yù)處理后1h、1.5h和2h，BMDM細(xì)胞總蛋白中Mer蛋白明顯增加，膜蛋白Mer蛋白中增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），細(xì)胞質(zhì)中Mer蛋白各時(shí)間點(diǎn)的變

9、化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，細(xì)胞培養(yǎng)液中的可溶性Mer蛋白明顯降低（P<0.05）；總蛋白中ADAM17蛋白含量無(wú)明顯變化，膜蛋白中ADAM17的含量明顯減少，細(xì)胞質(zhì)中ADAM17的含量明顯增加（P<0.05）；與未處理組細(xì)胞內(nèi)的AMPK的磷酸化水平比較，異氟烷預(yù)處理后0.5h、1h、1.5h和2h細(xì)胞內(nèi)的AMPK的磷酸化含量有增加趨勢(shì)，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；AMPK激酶的抑制劑化合物Compound C能夠抑制BMDM細(xì)胞AMPK

10、的磷酸化水平，抑制Mer蛋白在BMDM細(xì)胞總蛋白中、膜蛋白水平增加，抑制ADAM17在膜蛋白中的減少，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。應(yīng)用干擾技術(shù)沉默BMDM細(xì)胞AMPK后，可以明顯抑制BMDM細(xì)胞Mer蛋白的表達(dá)（P<0.05）。通過(guò)沉默BMDM細(xì)胞AMPK后，能抑制異氟烷增強(qiáng)BMDM的胞葬作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：吸入麻醉藥異氟烷可以誘導(dǎo)BMDM細(xì)胞中的AMPK的磷酸化,減少細(xì)胞膜蛋白ADAM

11、17的含量，從而影響ADAM17的功能，抑制可溶性蛋白Mer的生成，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞膜蛋白Mer的增加,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的胞葬作用。
　　第三部分異氟烷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺炎癥損傷的恢復(fù)的影響
　　目的：探討吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺炎癥損傷恢復(fù)的影響。
　　方法：通過(guò)建立脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺損傷模型，方案一，小鼠隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照（CON）組；經(jīng)氣管給予等體積的生理鹽水；脂多糖（LPS）組，滴入LPS（3.5m

12、g/kg）經(jīng)氣管內(nèi)刺激；CLOD+LPS組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細(xì)胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激；CLOD+LPS+BMDM-CON組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細(xì)胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d后氣管內(nèi)滴入BMDM細(xì)胞2×106（40μL）；CLOD+ LPS+BMDM-ISO組，先提前2d用CLOD打掉肺泡巨噬細(xì)胞，后氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d，后

13、氣管內(nèi)滴入用異氟烷處理過(guò)的BMDM細(xì)胞107（40μL）。方案二：空白對(duì)照組；脂多糖（LPS）組，氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激；LPS+ISO組;氣管內(nèi)滴入LPS（3.5mg/kg）刺激，刺激后3d，給小鼠吸入異氟烷1h。兩種方案于LPS刺激之后1、3、5、7和9d收集肺組織標(biāo)本和相應(yīng)的肺泡灌洗液，進(jìn)行監(jiān)測(cè)肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞、蛋白和細(xì)胞因子的變化及肺組織內(nèi)MPO、肺葉濕干比及肺組織的切片的變化。在方案一的基礎(chǔ)上增加一組C

14、LOD+LPS+BMDM（AMPKsiRNA）-ISO組,觀(guān)察脂多糖刺激后第五天，肺泡灌洗液中TNF-α、白介素-6、TGF-β和白介素-10的水平變化。
　　結(jié)果：在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d，CLOD+LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量及顯著低于CLOD+ LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BM

15、DM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)目、灌洗液中蛋白、TNF-α和IL-6含量下降更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CLOD+ LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺組織內(nèi)MPO變化和肺組織濕干比顯著低于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織內(nèi)MP

16、O變化和肺組織濕干比下降更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CLOD+ LPS+BMDM-CON組和CLOD+ LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著高于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。脂多糖刺激后5d肺組織切片

17、HE染色結(jié)果顯示CLOD+LPS+BMDM-CON組和CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織損傷評(píng)分顯著低于CLOD+LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-CON組比較，CLOD+LPS+BMDM-ISO組肺組織損傷評(píng)分比較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。按照第二種方案處理結(jié)果：在脂多糖刺激小鼠后5、7和9d，LPS+ISO組肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)目、灌洗液中蛋白水平、TNF-α和白

18、介素-6含量顯著低于LPS組（P<0.05）。LPS+ISO組肺組織內(nèi)MPO變化和肺組織濕干比顯著低于LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LPS+ISO組肺泡灌洗液中TGF-β和IL-10含量顯著高于LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肺組織切片HE染色結(jié)果顯示LPS+ISO組肺組織損傷評(píng)分顯著低于LPS組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CLOD+LPS+BMDM-ISO組相比，CLOD+LPS+BMDM（A