富氫液對Heymann腎炎大鼠腎臟Nrf2-HO-1信號通路及TGF-β1、IV型膠原表達的影響.pdf

1、目的：Heymann腎炎是人類特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）的經典動物腎炎模型，具有人類特發(fā)性膜性腎病的臨床及病理特點。近些年的研究結果顯示 Heymann腎炎發(fā)病機制涉及補體活化、氧化反應、細胞因子激活、內質網應激和自噬等個多方面。在Heymann腎炎發(fā)病過程中，補體活化后產生膜攻擊復合物C5b-9，可誘導生成大量的活性氧。大量動物實驗證實，活性氧的堆積可激活Nrf2/HO

2、-1信號通路，發(fā)揮抗氧化應激作用，從而阻止脂質過氧化反應的發(fā)生。此外，在Heymann腎炎后期，主要的病理改變是IV型膠原、纖維連接蛋白和層粘連蛋白等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分增多堆積。研究證實轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可以促進ECM的形成，在腎小球硬化及纖維化機制中占有重要地位。這樣，氧化反應與炎癥因子協(xié)調作用，共同導致了腎臟組織

3、病變。探索新型的治療方法，阻斷或抑制氧化和炎癥反應，延緩腎功能損害，一直都是腎臟病領域研究的熱點。早些年，國內外學者一直認為氫氣屬于生理性惰性氣體。隨著研究的深入，越來越多的證據顯示氫氣具有選擇性抗氧化、抗炎及抗凋亡的作用，但與腎臟病相關的研究報道甚少。
　　本課題擬通過建立主動型Heymann腎炎（Active Heymann Nephritis，AHN）大鼠模型，應用免疫組織化學染色、實時定量PCR等方法檢測腎臟組織中Nrf2

4、、HO-1及TGF-β1、IV型膠原的表達情況。并給予富氫液（15mg/Kg）進行干預，觀察AHN大鼠腎臟組織內各指標的表達狀況，探討富氫液對其干預作用及機制，為人類IMN的預防和治療提供新的思路。
　　方法：選擇SD大鼠（健康清潔級，雄性）36只，體重約200±20g，隨機分為正常對照（NC組，n=12）、Heymann腎炎模型組（HN組，n=12）、富氫液干預組（HRS組，n=12）。適應性喂養(yǎng)1周后，給予HN組、HRS組大鼠

5、腹腔注射免疫原2ml/只(含腎皮質0.5g)，制備 Heymann腎炎大鼠模型；NC組大鼠給予腹腔注射佐劑對照2ml/只，作為正常對照；腹腔注射方式均為每兩周一次，共6次。自注射免疫原第一次起，HRS組大鼠每日給予（濃度0.8mmol/L）富氫液15ml/kg灌胃，NC組、HN組則每日給予等量的生理鹽水灌胃。實驗期間，所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度（20℃-26℃）且濕度（45％-70%）的相對恒定的環(huán)境中，自由進食水。于4周末、8周末，將大鼠置

6、于清潔代謝籠內，留取24小時尿并測定24小時尿蛋白定量。大鼠在注射免疫原后4周末，高于正常大鼠24小時尿蛋白定量則為腎炎形成的標志。至第一次注射免疫原后12周末、14周末，每組隨機選取6只大鼠，測定24小時尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮。并收集大鼠腎組織標本，制備病理組織切片，以備蘇木素-伊紅（HE）染色、糖原（PAS）染色及免疫組織化學染色，觀察大鼠腎組織病理變化；免疫組織化學及實時定量PCR方法檢測Nrf2、HO-1及TGF-β1、I

7、V型膠原的表達情況。實驗所得數據用均數±標準差（x±S）表示，應用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行處理，滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗的數據采用單因素方差分析，不滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗的數據資料采用非參數檢驗分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.一般情況
　　NC組大鼠飲食正常，毛發(fā)光亮柔順，生長發(fā)育良好。HN組、HRS組大鼠腹腔注射免疫原后逐漸出現(xiàn)飲食減少，反應遲鈍，毛發(fā)無光，部分大鼠出現(xiàn)腹水。其中

8、HRS大鼠較HN組大鼠情況稍好。
　　2.生化指標
　　2.1 24小時尿蛋白定量
　　與同期NC組相比，所有時間點中，HN組、HRS組大鼠24小時尿蛋白水平均升高（P＜0.05）。其中，與HN組相比，4周末，HRS組大鼠24小時尿蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）；8周末、12周末、14周末，HRS組大鼠24小時尿蛋白水平顯著下降（P＜0.05）。
　　2.2 血肌酐、血尿素氮
　　與同期NC組相比，12

9、周末、14周末，HN組、HRS組大鼠血肌酐、血尿素氮水平升高（P＜0.05）。與HN組相比，12周末，HRS組血肌酐水平未見明顯變化（P＞0.05），而血尿素氮水平出現(xiàn)下降（P＜0.05）；14周末，HRS組血肌酐、血尿素氮水平均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）。
　　3.腎臟組織變化
　　光鏡下顯示，NC組大鼠腎組織結構正常，基底膜均勻一致，無增厚，無系膜細胞、系膜基質增多等異常改變。與NC組相比，HN組和HRS大鼠腎小球基底

10、膜呈不同程度增厚,內皮細胞胞質腫脹;腎小管結構紊亂,間質內有局灶性淋巴細胞及漿細胞浸潤。且HN組較HRS組腎臟組織病變更加嚴重，14周末較12周末病理改變更明顯。
　　4.免疫組織化學檢測
　　與同期NC組相比，12周末、14周末時，HRS組、HN組Nrf2、HO-1、TGF-β1、IV型膠原表達均增多（P＜0.05）；與同期HN組相比，HRS組TGF-β1、IV型膠原表達水平下降（P＜0.05），Nrf2、HO-1表達有所

11、增多（P＜0.05）。
　　5.實時定量PCR檢測
　　與同期NC組相比，12周末、14周末時，HRS組、HN組Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、TGF-β1 mRNA、IV型膠原mRNA表達均增多（P＜0.05）；與同期HN組相比，HRS組TGF-β1 mRNA、IV型膠原mRNA表達水平不同程度下降（P＜0.05），而Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達有所增多（P＜0.05）。
　　結論：