精子RNase T2和精漿TNF-α、IL-6及β-defensin 2與男性不育的相關(guān)性.pdf

1、全球約有10%～15%的人口患有不育不孕,其中20%～39%是由男性因素所導(dǎo)致。而且據(jù)國(guó)內(nèi)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)的適齡生育夫婦中，至少有12.5%的夫婦患有不孕和不育癥，患者總數(shù)已超過(guò)4000萬(wàn)，其中由男性因素引起的不育約占50%。男性不育的發(fā)病率呈快速上升的趨勢(shì)，其中很重要的原因就是男性精子數(shù)量和質(zhì)量在逐年下降。研究表明，81.84%男性不育癥患者存在精子運(yùn)動(dòng)不良，弱精子癥已經(jīng)成為影響男性不育的重要因素。
　　影響精子運(yùn)動(dòng)能力的因素是

2、多方面的，生殖道或生殖腺體的急慢性炎癥、精液液化異常、免疫因素、內(nèi)分泌因素、精索靜脈曲張等都會(huì)直接或間接影響精子的運(yùn)動(dòng)能力，而更多的則是原因不明的特發(fā)性弱精子癥。近年來(lái)，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，超重和肥胖人口在逐年增加。有研究證實(shí)男性肥胖除了對(duì)精液質(zhì)量有著不良影響外，同時(shí)也影響妊娠結(jié)局及子代健康。相關(guān)研究也表明，通過(guò)改變生活方式將體重控制在正常范圍內(nèi)，可以有效改善男性的精子質(zhì)量。因此，肥胖也是引起弱精子癥的可能因素之一，而且肥胖是

3、男性不育的危險(xiǎn)因素。
　　人精液由5%的精子和95%的精漿組成。人精子分為頭、頸、尾三部分。精子頭部呈橢圓形，內(nèi)含有遺傳物質(zhì)；頸部較短，內(nèi)有中心粒；精子尾部分為中段、主段和末段，成熟的精子靠精子尾部的擺動(dòng)而獲得運(yùn)動(dòng)能力。人精漿里含有果糖和蛋白質(zhì)，是精子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還含有前列腺素和一些酶類(lèi)物質(zhì)，對(duì)精子的發(fā)生、發(fā)育、成熟及運(yùn)動(dòng)能力起重要作用。為了研究由弱精子癥及肥胖癥引起的男性不育癥的發(fā)病機(jī)制，生殖醫(yī)學(xué)和生殖生物學(xué)都致力于在精子上

4、或精漿中尋找導(dǎo)致精子運(yùn)動(dòng)功能下調(diào)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，探索它們對(duì)精子質(zhì)量的影響以及與男性不育的相關(guān)性。
　　精子尾部的主要結(jié)構(gòu)是貫穿于中央的軸絲，在解剖學(xué)上縱行排列著收縮蛋白質(zhì)、粗大纖維和與它相關(guān)聯(lián)的微絲及微管。哺乳動(dòng)物在精子的頭部、頸部和尾部表達(dá)有豐富的肌動(dòng)蛋白（actin），肌動(dòng)蛋白、粗大纖維、微管和微絲所構(gòu)成的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)能力的產(chǎn)生有重要的作用。精子的運(yùn)動(dòng)力主要靠中段線粒體鞘內(nèi)的線粒體提供能量，以及表達(dá)在微管上的動(dòng)力

5、蛋白（Dynein）等介導(dǎo)尾部相鄰的微管、微絲之間產(chǎn)生滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)，從而調(diào)節(jié)精子尾部的彎曲與擺動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　有研究發(fā)現(xiàn)ACTIBIND蛋白可以通過(guò)和血管生成素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合腫瘤細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。ACTIBIND是由黑曲霉表達(dá)的蛋白，為核糖核酸酶T2（RNase T2）家族成員之一。核糖核酸酶T2家族則是廣泛存在于原核生物、真核生物上的一類(lèi)底物非特異性核糖核酸內(nèi)切酶，能參與細(xì)胞核糖核酸分解、細(xì)胞免疫應(yīng)答、細(xì)胞

6、增殖與運(yùn)動(dòng)等多種功能。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，核糖核酸酶 T2家族的基因序列和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)在各個(gè)物種之間具有高度的相似性?；贏CTIBIND蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞的生產(chǎn)和遷移，我們推測(cè)：核糖核酸酶T2與精子上的肌動(dòng)蛋白結(jié)合影響精子的運(yùn)動(dòng)。為此，我們課題組曾對(duì)正常男性精子與核糖核酸酶T2作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)：核糖核酸酶T2表達(dá)在人類(lèi)精子的頂體部位、頸部以及尾部鞭毛部位，與actin表達(dá)具有部分共定位，尤其是在與精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)的尾部；

7、并且核糖核酸酶 T2可以明顯抑制人精子活動(dòng)力及前向運(yùn)動(dòng)力且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。據(jù)此結(jié)論，我們進(jìn)一步推測(cè)，在弱精癥患者的精液中是否有過(guò)量表達(dá)的核糖核酸酶T2，其表達(dá)異常導(dǎo)致男性精液質(zhì)量下降呢？
　　另一方面，研究表明肥胖可引起男性精液質(zhì)量下降，繼而導(dǎo)致男性不育。肥胖是由多因素引起的慢性代謝性疾病，是一種全身性慢性低度炎癥狀態(tài)，在一定程度上表現(xiàn)為明顯超重及脂肪積聚過(guò)多。在肥胖的狀態(tài)下，脂肪細(xì)胞可以被激活變成炎癥細(xì)胞，并分泌多種炎癥細(xì)

8、胞因子如α腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6），使其含量水平急劇上升。人β-defensin2（HBD-2）是人體中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)表達(dá)的防御素，可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)。正常情況下機(jī)體的HBD-2的表達(dá)水平很低，當(dāng)受到促炎癥因子和微生物刺激后，其表達(dá)迅速上調(diào)。由于肥胖者精漿TNF-α和IL-6水平升高，后者的升高刺激HBD-2的表達(dá)水平升高。已有血清學(xué)研究證實(shí)，男性肥胖患者體內(nèi)不僅TNF-α和IL-6水平升高

9、，而且與男性精液密度及前向運(yùn)動(dòng)精子率下降存在一定的相關(guān)性。但是肥胖是否引起精漿中炎癥因子及 HBD-2表達(dá)水平的改變卻一直未見(jiàn)報(bào)道。那么肥胖者精漿中它們水平是否升高，而且對(duì)男性精液質(zhì)量的影響以及與男性不育的相關(guān)關(guān)系又如何呢？
　　綜合上述的推測(cè)，從2013年6月到2016年4月，我們對(duì)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門(mén)診就診的男性患者進(jìn)行分組，對(duì)他們進(jìn)行精液分析并分離收集精子和精漿標(biāo)本。
　　1）收集弱精標(biāo)本10

10、5例，正常精液標(biāo)本100例。通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞檢測(cè)核糖核酸酶T2在兩組精子標(biāo)本的含量，我們發(fā)現(xiàn)核糖核酸酶T2在弱精癥患者中熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常組標(biāo)本（P<0.05）；通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)人精子核糖核酸酶T2表含量與精子活力呈負(fù)相關(guān)（r=-0.291，P<0.01）。另外，我們從黑曲霉菌的培養(yǎng)液中分離、純化出具有高生物活性的核糖核酸酶T2，同樣可以明顯抑制人精子前向運(yùn)動(dòng)力和總活動(dòng)力，且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　2）收集1

11、30例超重及肥胖男性不育患者及45例正常生育男性的精液標(biāo)本。通過(guò)ELISA法檢測(cè)精漿中TNF-α、IL-6、β-defensin2的水平含量，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子上β-defensin2的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)正常生育男性，肥胖男性不育患者精漿TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.01），β-defensin2水平明顯升高（P<0.05），而精子β-defensin2表達(dá)含量明顯降低（P<0.05）。同時(shí)對(duì)體重指數(shù)（BMI）、

12、精液參數(shù)以及精漿TNF-α、IL-6及β-defensin2水平進(jìn)行單因素相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)：肥胖組與正常組相比，精液量、A級(jí)運(yùn)動(dòng)精子、精子活力及總活力均顯著下降（P<0.01），肥胖組與正常組相比，d級(jí)精子，精漿TNF-α及IL-6水平有顯著升高（P<0.01）。BMI與精液量和A級(jí)精子呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。精漿TNF-α及IL-6水平與正常精子形態(tài)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與BMI呈正相關(guān)（P<0.01）。
　　通過(guò)上述